微生物转化虎杖苷粗提物生成白藜芦醇的研究
作者：袁润蕾，徐萌萌，孙艳娟，李猷，孙启玲，万端极
【摘要】 目的 利用一株根霉菌对虎杖苷粗提物进行液态发酵，使虎杖苷转化成白藜芦醇。方法采用单因素实验确定氮源种类及添加量，通过正交实验法优化发酵条件。结果在10%虎杖苷粗提物中添加1.5%的尿素作为氮源，采用薄层色谱法（TLC）确定在优化发酵条件下转化时间为26.8 h，通过高效液相色谱法HPLC证明虎杖苷转化为白藜芦醇，转化率95.8%。结论虎杖苷粗提物可以通过微生物发酵得到白藜芦醇。
【关键词】 虎杖苷；白藜芦醇；根霉菌；微生物转化
Abstract:ObjectivePolydatin in Polydatin extraction was transformed to resveratrol in liquid state fermentation by R. nigricans. MethodsThe kind and the append mate of nitrogen source were confirmed by the single factor experiment. The conditions of fermentation were optimized by orthogonal experiment. ResultsCarbamide was the optimum nitrogen source and the append mate was 1.5%. Under the optimized condition the transformation time was 26.8h. It was prooved that Polydatin could be transformed to Resvertrol by high performance liquid chromatography and the transformation rate could reach 95.8%. ConclusionPolydatin in Polydatin extraction can be transformed to resveratrol by microbial transformation.
Key words:Polydatin；Resveratrol；R. nigricans; Microbial trasformation
虎杖为蓼科植物Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎，别名苦杖根、活血龙、大虫杖等［1］。其中重要的活性成分为二苯乙烯类的白藜芦醇（Resveratrol）和白藜芦醇苷(Polydatin)，也叫虎杖苷。白藜芦醇是一种活性多酚类物质［2］，具有明显的降低血脂，预防心脑血管疾病以及抗癌等重要作用，是目前世界上一种最新的药用保健活性物质，有望成为抗癌新药［3］。目前，该产品国际市场需求量大，具有良好的市场前景。天然白藜芦醇主要以葡萄糖苷（虎杖苷）的形式存在于虎杖中，虎杖中的白藜芦醇含量在0.1%～0.2%左右，虎杖苷的含量在2%左右，虎杖苷的含量明显高于白藜芦醇。理论上，采取化学法能将虎杖苷转化为白藜芦醇，但其工序繁杂并生成大量的异构体，造成分离纯化困难，生产成本非常高，不被认可。目前，生物法是直接利用虎杖进行带渣发酵，通过根霉菌分泌的酶切断白藜芦醇苷的糖苷键，转化得到白藜芦醇（图1）， 该法存在发酵体积庞大、成本高、发酵浓度无法提高等问题［4］。因此本课题利用虎杖苷粗提物进行发酵，可以提高发酵体系中虎杖苷的含量、缩小发酵体积、提高发酵效率，更易于白藜芦醇这种医药中间体的化，为生产白藜芦醇提供了一种便捷、有效的方法。
1 器材与方法
1.1 仪器与药品DOINEX高效液相色谱仪；AN0298分析天平（上海民桥精密仪器有限公司）；虎杖（湖北省药材公司）；虎杖苷标准品、白藜芦醇标准品（成都思科华有限责任公司）；其它试剂均为分析纯；无机盐浓缩液：KH2PO4 0.1%, MgSO4 0.05%,(NH4)2SO4 0.1%；虎杖苷粗提物（粉末状，虎杖苷含量14.78%）。
1.2 菌种编号T-34，由四川大学生物资源与生态环境部重点实验室提供，从界分离筛选得到，经鉴定为一株根霉菌。
1.3 方法
1.3.1 虎杖苷和白藜芦醇的TLC检测方法 虎杖苷和白藜芦醇的TLC法薄层色谱［5］条件，展开剂：醋酸乙酯-丙酮 -醋酸体积比为6∶2∶0.5；显色剂：3 %磷钼酸无水乙醇溶液, 110 ℃显色3 min［5］。
1.3.2 虎杖苷和白藜芦醇的高效液相色谱法HPLC检测方法色谱柱C18柱（4.6 mm×150 mm）, 柱温25 ℃, 流动相甲醇-水为40∶60；流速1 ml/min, 进样量20 μl,检测波长305 nm。根据标准样的峰面积和进样浓度作回归曲线，白藜芦醇的回归方程为Y = 1.40×108X +1.21×104,相关系数r=0.999 913，在20～100 μg/ml范围内和峰面积成线性关系；虎杖苷的回归方程为Y=9.61×107X-1.84×105，相关系数为r＝0.999 82，在20 ～100 μg/ml范围内和峰面积成线性关系。
1.3.3 氮源的选择
以10%虎杖苷粗提物添加1%无机盐浓缩液作为发酵培养基，分别在培养基中添加1%的硝酸铵、氯化铵、大豆粉、酵母膏、硫酸铵、尿素等氮源，180 r/min，30℃培养，通过检测虎杖苷的完全转化时间确定添加的氮源种类。
1.3.4 氮源加入量的确定
10%虎杖苷粗提物添加1%无机盐浓缩液的发酵培养基中，分别添加0%，1%，1.5%，2%，2.5%的尿素，180 r/min，30℃培养，通过检测虎杖苷的完全转化时间确定尿素的添加量。
1.3.5 发酵条件的优化
以虎杖苷乙醇粗提物回收乙醇后，烘干，制成虎杖苷粗提物粉末，虎杖苷含量14.78%。按10%的加入量加入发酵培养基中，pH，121℃灭菌25 min。将菌种T-34以菌丝体形式接入发酵培养基中，添加1%无机盐浓度浓缩液，采用正交实验法优化发酵温度、装液量、接种量、转速等发酵条件。
2 结果与讨论
2.1 发酵条件优化实验
2.1.1 氮源的选择氮为真菌干重的8%～14%，大量的无机和有机含氮化合物都可用来满足微生物对这种元素的需求。不同种类的微生物其氮的代谢途径不尽相同，因此有必要对培养基中添加的氮源进行选择，结果见表1。表1 不同氮源对苷转化时间的影响（略）
从实验结果可知，在选择硝酸铵、氯化铵、大豆粉、酵母膏、硫酸铵、尿素这6种氮源，利用尿素做氮源时，转化时间最短，其它5种均大于38个小时，因此从转化时间上考虑使用尿素作为培养基的氮源物质。
2.1. 2 氮源添加量的确定
微生物的生长及转化都有一个合适的碳氮比，因此在培养基基质中需要提供与此相当的含氮量，结果见表2。表2 氮源添加量对苷转化时间的影响（略）
从实验结果可知，尿素添加量0%～1.5%时，转化时间随氮源的增加而缩短；当氮源添加量为1.5%和2.5%时，转化时间最短，都为30 h。因此，从培养基成本考虑选择添加量为1.5%。
2.1.3 发酵条件的确定通过正交实验法来确定最佳的发酵条件，结果见表3。表3 虎杖苷粗提物液态发酵正交优化实验（略）
通过正交实验法得出虎杖苷粗提物液态发酵的最佳条件为（A3B1C3D3）：培养温度32℃，装液量20%，接种量30%，转速200 r/min，对实验结果分析发现，各因素对发酵影响大小顺序为：培养温度>接种量>装液量>转速。按最佳的发酵条件进行虎杖苷的液态发酵验证实验，经HPLC检测白藜芦醇苷粗提物中的虎杖苷在26.8 h转化95.8%。此结果优于正交表中的9个实验，证明了该工艺的合理性和稳定性。
2.4 产物的鉴定虎杖苷和白藜芦醇标准品混合进样后的HPLC定位，虎杖苷在4.2 min出峰，白藜芦醇在9.0 min出峰。见图2～4。
虎杖苷粗提物在4.2 min处有较大峰值，在9.0 min处有一个小峰出现；对应虎杖苷粗提物转化后在4 min左右没有明显的峰值出现，保留峰值基本消失，在9.0 min处有较大峰值。发酵后的产物与白藜芦醇标准品的出峰时间一致，证明微生物将虎杖苷粗提物中的虎杖苷转化为白藜芦醇。
3 结论
利用微生物转化虎杖苷含量为14.78%的虎杖苷粗提物，在最佳发酵条件：培养温度32℃，装液量20%，接种量30%，转速200 r/min下，经过26.8 h，虎杖苷转化率可达95.8%。证明利用虎杖苷粗提物进行微生物转化的方法是可行的、稳定的，此工艺更符合化生产，步骤简单，易于控制，原材料利用率高。 针对白藜芦醇需求量大，且国内亟待解决并值得深入研究的开发命题包括通过先进工艺获得高含量天然白藜芦醇产品，来满足日益增长的国内外对天然白藜芦醇的需求。本研究内容还未见报道，为获得天然白藜芦醇生产提供了一种可行的创新思路。
【】
［1］国家药典委员会. 药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：145.
［2］梁光义. 中药化学［M］.北京：中医古籍出版社，2005：57.
