青羊参多糖硫酸酯体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型活性研究

                    作者：姜海鸥，黄雪霜，王斌，张峻

【摘要】  　　目的 体外测定青羊参多糖硫酸酯抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的活性。方法采用 MTT法检测化合物对疱疹病毒感染Vero细胞的保护作用。结果青羊参多糖硫酸酯体外抗HSV-Ⅱ的EC50为69.9μg/ml，指数为103。结论在体外，青羊参多糖硫酸酯有较显著的抗HSV-Ⅱ的作用。

【关键词】  青羊参多糖硫酸酯； 单纯疱疹病毒Ⅱ型； 抗病毒活性

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the Anti-HSV-Ⅱ activity of sulfated polysaccharide from Cynanchum otophyllum Schneid in vitro.  MethodsVero cells were infected by HSV-Ⅱ and the inhibitory effects of sulfated polysaccharide from Cynanchum otophyllum Schneid were evaluated by MTT. Results For HSV-Ⅱ,50% effective concentration(EC50) and therapeutic index(TI) of sulfated polysaccharide from Cynanchum otophyllum Schneid were 69.9 μg/ml and 103, respectively.  ConclusionSulfated polysaccharide from Cynanchum otophyllum Schneid has obvious HSV-Ⅱ inhibitory effiect in vitro.

　　Key words:Sulfated polysaccharide from Cynanchum otophyllum Schneid；HSV-Ⅱ ;  Antiviral activity

    单纯疱疹病毒（HSV）是一种常见的传染性病原体，HSV-Ⅱ可引起外阴疱疹，是宫颈癌的协同诱因。阿昔洛韦（ACV）治疗人类HSV感染易产生耐药毒株［1］。因此，继续寻找高效、价廉的抗单纯疱疹病毒新药已势在必行。自1987年发现的硫酸酯化多糖具有抑制艾滋病毒HIV活性以来，多糖硫酸化的抗病毒活性研究成为热点［2］，但关于青羊参多糖硫酸酯的抗病毒实验研究甚少。本文对青羊参多糖硫酸酯体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的药效进行了实验研究。现报道如下。

　　1  材料和方法

　　1.1  试剂阿昔洛韦（acyclovir）购自湖北潜江制药股份有限公司；待测样品青羊参多糖硫酸酯由本实验室提供。MTT (3，4，5－dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)和十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）均购自Sigma公司，N，N'-二甲基甲酰胺（N，N'－Dimethyl formamine，DMF）购自上海试剂一厂。

　　1.2 溶液完全培养基为RPMI-1640（Invitrogen 公司），含有10%的小牛血清（Hyclone公司），2 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES，50 mmol/L 2-ME，100 u/ml的青、链霉素。磷酸盐缓冲液（PBS，0.01M，pH＝7.4）。

　　1.3 细胞和病毒Vero为非洲绿猴肾细胞，HSV-Ⅱ均由英国MRC惠赠。

　　1.4 病毒滴度测定　

　　将病毒悬液作连续10 倍稀释,常规方法感染单层Vero 细胞，37℃，5 % CO2 培养3 d，观察细胞病变( CPE) 情况, 按Reed-Muench方法TCID50。

　　1.5 以MTT法检测样品对Vero细胞的毒性

　　取对数生长期的细胞，离心（1,000 r/min，10 min）后将细胞重悬，细胞浓度调至2×106/ml。在96孔细胞培养板上将被检样品2倍倍比稀释，共设6个梯度，每个梯度设3个重复孔，另设阳性对照组及细胞对照组。分别加细胞悬液后，置37℃，5%CO2培养箱中孵育。于第4天用酶标仪（Bio-Rad 3550 ELISA reader）测定各孔的OD值（测定波长595 nm，波长655 nm）。按下列公式计算被检样品对细胞生长的抑制率，并计算IC50（50% inhibition concentration）值。
   
　　细胞生长抑制率（%）＝（1－实验孔OD值/对照孔OD值）×100%

　　1.6 MTT法检测

　　化合物对疱疹病毒感染Vero细胞的保护作用在96孔平底培养板上，将待测化合物用RPMI1640培养基进行2倍系列稀释。共6个稀释度，每孔100 ml, 设两个重复孔。同时设置不含化合物的未感染病毒的细胞对照组和感染病毒的病毒对照组；离心Vero细胞（1  000 r/min，10 min），用完全培养基重悬细胞，每孔加入75 μl 4×104细胞；感染HSV的每个稀释度中的两孔加入25 μl病毒，对照组加入25 ml培养基。每孔终体积200 μl；置37℃，5%CO2培养箱中培养，第3天补加100 μl新鲜培基；第6天将96孔细胞培养板低速离心后（1 000 r/min,10 min），吸弃250 ml养上清，再加20 ml MTT溶液（5 mg/ml），37℃, 5%CO2培养箱中孵育4 h左右，加入20% SDS-50%DMF(pH 4.7), 孵育过夜；第7天用酶标仪（Bio-Rad 3550 ELISA reader）测定各孔的OD值（测定波长595 nm，参考波长655 nm），根据下面公式计算出化合物对HSV-Ⅱ感染细胞的保护率, 并用插入法计算EC50（50% Effective concentration）值和治疗指数TI(Therapeutic index)值：      
   
　　细胞保护率（%） ＝

    实验孔OD值－对照孔（HSV+）OD值（对照孔（HSV－）OD值－对照孔（HSV+）OD值）×100%

    并进一步计算出治疗指数(therapeutic index，TI) (TI= IC50/ EC50)

　　2  结果

　　2.1  病毒滴度　

　　本室保存的HSV-Ⅱ 接种在Vero细胞上的滴度为106.0/ml 。实验用病毒浓度为80TCID50。

　　2.2 样品青羊参多糖硫酸酯体外对Vero的毒性作用样品青羊参多糖硫酸酯对Vero的IC50值为7  170 μg/ml，而阳性对照ACV对50%细胞产生毒性的浓度高于15 000 μg/ml（见表1），由此可见青羊参多糖硫酸酯对Vero的毒性高于ACV。

　　2.3 样品青羊参多糖硫酸酯体外对HSV-Ⅱ病毒的抑制作用阳性对照ACV显示出有效的保护HSV-Ⅱ感染Vero细胞作用，其EC50为5.12 μg/ml，治疗指数TI值为2 910。青羊参多糖硫酸酯的EC50值分别为69.9μg/ml，治疗指数为103，见表1。与阳性对照药物ACV相比，它的治疗指数（TI）虽然偏低，但它对HSV-Ⅱ感染Vero细胞也显示出较强的保护作用。表1  待测化合物对Ⅱ型单纯疱疹病毒（略）

　　3 讨论

    近年来,多糖的研究引起了国内外许多学者极大的兴趣。天然中性多糖经化学修饰后其抗病毒作用显著增强［3］。多糖进行硫酸化修饰后，成为阴离子聚合体，带负电荷的硫酸多糖可与带正电荷的V3区域结合，使病毒颗粒不能与CD4细胞结合［4］；另外，多糖被硫酸化修饰后，带有很高的阴电荷，可作为一种粘性分子粘附在病毒或细胞表面，从而非特异性地阻碍了病毒和细胞的融合［5，6］。例如：牛膝多糖本身无抗病毒活性，硫酸化以后有抑制乙肝病毒和单纯疱疹病毒的活性［7］；金顶侧耳多糖有一定的抗病毒作用，但活性不大，通过硫酸化修饰后有了明显的抗柯萨奇病毒的活性［8］。这些都说明硫酸化多糖具有一定的抗病毒的普遍意义。

    青羊参多糖是从萝藦科鹅绒藤属药用植物青羊参的干燥根中提取分离出来的,具有补肾、镇痉、祛风湿、调节免疫功能等作用［9］。但作为一种抗病毒药研究较少。本研究将其硫酸化修饰后，进行抗HSV-Ⅱ活性研究。本研究结果表明青羊参多糖硫酸酯毒性较小,在7 170 μg/ ml 以上才对Vero 细胞产生明显毒性。动物实验和临床用药表明［10］，药物在动物体内毒性较低,且大剂量没有明显副作用。其抗HSV-Ⅱ作用虽然较无环鸟苷（ACV）低，但在样品不产生毒性范围内，对HSV-Ⅱ感染Vero细胞显示出较强的抑制作用。关于青羊参多糖硫酸酯抗病毒的作用机制以及体内抗病毒活性有待进一步深入研究。

【】
  　　［1］Marthez CM, et al. Cidofovir use in acyclovir resistant herpes infection［J］. Annpharmacother,1997,31(12):1519.

　　［2］Ito M, Baha M, Sato A ,et al. Inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on the replication of human immunedficency virus (HIV) in vitro［J］. Antiviral Res , 1987 ,7 : 361.

　　［3］Baba M, Schols D, Fuau wus R,et al. Sulfated polysaccharides as potentinhibitors of HIV-induced syneytiumformation［J］. J Aids , 1990 , 3 : 493.

　　［4］辛现良，丁华，耿美玉,等. 海洋硫酸多糖911抗艾滋病毒作用及其机理研究-体内对猴免疫缺陷病毒（SIV）增殖的影响［J］.海洋药物杂志，2000，19（6）：4.

　　［5］蒋岩，陈春英，裴丽健，等. 硫酸酯化箬叶抗HIV-1机制的初步研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2000,14（1）：56.

　　［6］Pratt R P, Phillips D M. Sulfated polysaccharides inhibit lymphocyte-to-epithelial transmission of human immunodeficiency virus-1［J］. Biol Reprod, 1996，54（1）: 173.

　　［7］田庚元, 李寿桐, 宋麦丽，等.牛膝多糖硫酸酯的合成及其抗病毒活性［J］. 药学学报, 1995 ,30 (2 ) :107.

　　［8］张丽萍，孙非，张翼伸. 化学修饰对金顶侧耳多糖抗病毒（CB5）活性的影响［J］. 生物化学杂志, 1994,10(2) ：150.

　　［9］黄泰康，丁志遵，赵守训，等. 本草纲目［M］.北京：中国医药科技出版社，2000：1444.

　　［10］中国院上海药物研究所第五研究室.防己科植物地不容的成分研究—千金藤素的药理［J］. 中草药通讯，1978 , 9∶26.