家兔血浆中北豆根碱的高效液相色谱法测定及药动学研究
作者：朱孝芹，臧亚如，张欢，刘翠哲
【摘要】 目的 建立家兔血浆中北豆根碱（RM）的HPLC分析方法，并对RM静注给药在家兔体内药动学过程进行分析研究。方法采用乙腈、二氯甲烷沉淀蛋白质并提取药物，采用HPLC法测定。色谱柱为Discovery C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈∶水∶磷酸=16∶84∶0.15(V∶V∶V)；检测波长208 nm；柱温为室温；流速0.5 ml·min-1；动物实验使用家兔6只，采用静脉注射给药（10 mg·kg-1），进行血药浓度测定和药动学参数。结果家兔血浆内源物质对药物测定无干扰，在血药浓度0.01～0.10 mg·ml-1范围内，浓度对峰面积有良好的线性关系，r= 0.999 8，提取回收率大于85%，方法回收率在98.3%～100.5%之间；日内、日间精密度RSD均小于10%（n=5）。北豆根碱在家兔体内的血药浓度-时间曲线符合二室模型。结论该法准确、简便、灵敏，可用于北豆根碱在兔体内药动学的研究。
【关键词】 北豆根总碱； 高效液相色谱法； 家兔； 药动学
AbstractObjectiveTo establish an HPLC method for determination of dauricine in rabbits plasma and study the related pharmacokinetics in rabbits after Ⅳ injection.MethodsAfter protein was precipitated with acetonitrile and dichloromethane, dauricine in plasma was determined on HPLC with UV detection at 208 nm, and the mobile phase was acetonitrile-water-phosphoric acid(16∶84∶0.15), running at a flow rate of 0.5 ml·min-1. We detected the concentration of dauricine in plasma and caculated pharmacokinetic parameters by 6 rabbits after Ⅳ injection (10 mg·kg-1).ResultsDauricine and endogenous could be separated. Its calibration curve was linear(r=0.999 8) within range of 0.01～0.1 mg·ml-1, the extraction recovery was more than 85%, the method recovery was within range of 98.3%～100.5%, the intra-day and inter-day precision was less than 10%(n=5). The concentration-time curve of dauricine in rabbits plasma could be fitted to two-compartment model.ConclusionThis method is sensitive, simple and accurate. It is suitable for the pharmacokinetic study of dauricine in rabbits.
Key wordsDauricine; HPLC; Rabbits; Pharmacokinetics
北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum DC.的干燥根茎，有清热解毒、祛风止痛作用，其有效部位是生物碱，现已知北豆根中含有近二十种生物碱，总碱含量可达1%以上，其中含量最高的生物碱为RM，其含量约占总生物碱的50%左右［1］。临床及实验均证实RM有良好的抗心律失常作用，且RM延长心肌动作电位时程作用存在剂量依赖性［2］。此外，北豆根碱还有抑制动脉血栓形成［3］、抗氧化［4］、抗肿瘤等［5］作用，具有广泛的应用前景。本实验采用单剂量静脉注射给药的方法，检测北豆根碱在家兔体内的血药浓度，应用3p87软件计算药动学参数。
1 仪器与试药
80-2B型台式离心机；80?2B型台式离心机；LG16?W型离心机；ZH-2型全自动涡流混合器；JASCO高效液相色谱仪（UV-15紫外-可见光检测器，RU?1580泵，CKChom色谱工作站，日本）；北豆根饮片，市售，承德产，经鉴定为蝙蝠葛；北豆根碱，对照品，自制（含量99.0%）；无水甲醇、磷酸为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Discovery C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为乙腈∶水∶磷酸=16∶84∶0.15(V∶V∶V)；检测波长208 nm；柱温为室温；流速0.5 ml·min-1。
2.2 对照品储备液精密称取北豆根碱对照品(60℃干燥至恒重)5.0 mg置25 ml容量瓶中，用流动相溶解并定容，作为对照品储备液。
2.3 样品处理方法［6］
精密吸取家兔血浆1 ml，加乙腈0.5 ml，二氯甲烷4 ml，旋涡混合5 min， 3 000 r·min-1离心15 min，将有机相转入10 ml离心管中，剩余水相再加入二氯甲烷2 ml，同法萃取并离心，合并2次萃取液，40℃水浴，N2吹干，残渣用流动相0.2 ml定容，充分溶解后，16 000 r·min-1离心5 min，取上清液20 μl进样。
2.4 标准曲线的制备取空白血浆1 ml置离心管中，加入北豆根碱对照品溶液，使其浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，0.10 mg·ml-1，按“样品处理方法”项下操作，以RM峰面积对RM血药浓度进行回归，其回归方程为：
Y = 1.53 ×108X + 1.8×103，r = 0.999 8(n=7) ，线性范围为0.01～0.1 mg·ml-1。
血浆样品典型色谱图见图1～3。
2.5 回收率测定分别取空白血浆1 ml，准确加入北豆根碱对照品溶液，配制高中低3个浓度的血浆样品，按“样品处理方法”项下操作，使其最终浓度为0.01，0.06，0.1 mg·ml-1，同时配制相同浓度的北豆根碱对照品水溶液进行测定，每个浓度测定5次。提取和方法回收率。结果见表1。表1 RM血浆样品回收率壹（略）
2.6 精密度测定将高、中、低浓度的对照品血浆分别进行日内精密度和日间精密度测定。结果见表2。表2 RM血浆样品的日内和日间精密度（略）
2.7 家兔血浆样品测定健康家兔6只，雌雄兼用，雌兔无孕，体重(1.6±0.24) kg，于耳缘静脉注射给予北豆根碱，剂量为10 mg·kg-1。于给药前和给药后2，5，10，20，30，45，60 min及1.5，2，4，6，8，12 h在另一侧耳缘静脉采血2.5ml,置肝素化离心管中，3 000 r·min-1离心15 min，分离血浆，-40℃贮存备用。血浆样品照“2.3”项下处理，测定。将实验结果绘制血药浓度-时间曲线如图4所示。应用3p87软件进行模型拟和。以AIC和拟和优度（r）为判别指标，确定血药浓度为二室模型。结果RM在家兔体内过程符合二室模型，其相关药动学参数见表3。表3 药动学参数（略）
3 讨论
家兔静脉注射10 mg·kg-1北豆根碱后，药物自中央室向周边室分布很快，T1/2α约为5 min，药物从中央室消除也较快，T1/2β约为1 h，Vd值大于实际的体液体积，说明北豆根碱因脂溶性强而在体内广泛分布。
有报道［7～8］，北豆根碱口服给药，在大鼠和狗体内存在着胃肠循环，C-T曲线明显存在着双峰现象。狗大剂量(50 mg·kg-1)口服给药时，药物消除为非线性，T1/2，CL，AUC等重要参数显著改变。但由于种属差异的问题，在兔体内是否也存在这一现象，尚需进一步研究。
在本实验中，从高效液相色谱图上可以看出，在给定的实验条件下，血浆中杂质不干扰测定，说明本实验的样品处理方和色谱条件可行，通过3 p87药动学软件处理数据，北豆根碱在家兔体内符合二室模型，可做为人体药动学研究的。
【参考文献】
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