大黄酚对脑缺血再灌注小鼠探索功能的影响
作者：王树 张力 张丹参 安芳 薛贵平
【摘要】 目的观察大黄酚对脑缺血再灌注小鼠认知探索功能的影响。 方法采用暂时性阻断两侧颈总动脉的方法制备小鼠脑缺血再灌注损伤的模型，进行探索实验，观察大黄酚10,1，0.1mg·kg-1 ip对脑缺血再灌注小鼠认知探索功能的改善作用，并对各剂量组全血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力和血浆中超氧化物歧化酶（SOD）活力进行测定。结果大黄酚可明显缩短脑缺血再灌注小鼠到达暗室时间、到达高端时间、到达明室时间，增加爬高端的次数，使小鼠在暗室和在明室滞留时间相近；并提高全血中GSH-Px活力和血浆中SOD活力。结论大黄酚对脑缺血再灌注小鼠所致探索认知行为功能障碍有明显的改善作用，其作用机制可能是增强抗氧化酶GSH-Px和SOD活力。
【关键词】 大黄酚 脑缺血再灌注 谷胱甘肽过氧化物酶 超氧化物歧化酶
Abstract:ObjectiveTo observe the effects of chrysophanol on cognitive and exploratory functions in mice with cerebral ischemia reperfusion.MethodsCerebral ischemia reperfusion injury was produced on conscious mice by temporarily obstructing bilateral common carolid arteries. The improvement effects of chrysophanol（10，1，0.1mg·kg-1，ip） on cognitive and exploratory functions in mice with cerebral ischemia reperfusion was observed using exploratory movement test and the glutathione peroxidase(GSH-Px) activities in blood and the superoxide dismutase(SOD) activities in plasma were measured.ResultsChrysophanol could shorten time of entering darkroom, time of climbing height, time of entering brightroom, increase number of climbing height, and showed no differences between staying time at darkroom and brightroom and increase the glutathione peroxidase(GSH-Px) activities in blood and the superoxide dismutase(SOD) activities in plasma. Conclusion Chrysophanol can improve the effects on the cognitive-behavior impairment in mice with cerebral ischemia reperfusion injury, perhaps the mechanism is involved in enhancing the activities of GSH-Px and SOD.
Key words:Chrysophanol; Cerebral ischemia reperfusion; GSH-PX; SOD
血管性痴呆(Vascular dementia, VD)是指由各种脑血管疾病引起的以认知损害为特征的一种综合征。VD主要行为表现为高级神经活动的智能障碍,特别是认知功能障碍,包括学习、记忆、思维等障碍，严重影响中老年人的生活质量。中药大黄作用广泛，有抗高血压、抗菌、泻下、抑制胆碱酯酶、抗衰老作用等许多作用。大黄酚（Chrysophanol , Chry）为大黄的有效成分之一，但药理作用报道却很少，仅限于传统的抗菌、泻下、止血等方面。我室前期工作已证实大黄酚能明显减少大鼠肝、脑过氧化脂质生成［1，2］。本实验采用小鼠短暂性脑缺血模型，研究大黄酚对脑缺血再灌注损伤后小鼠认知探索功能的影响，探讨其改善认知探索功能障碍的机制，为其应用于临床血管性痴呆疾病提供理论和实验依据。
1 器材
1.1 药品和试剂大黄酚（分析纯，药品生物制品检定所），实验前用N，N-二甲基甲酰胺溶解，聚山梨酯-80助溶，生理盐水稀释至所需浓度，N，N-二甲基甲酰胺：聚山梨酯-80：生理盐水等于1∶1∶8。谷胱甘肽过氧化物酶活力测试盒，超氧化物歧化酶测试盒：南京建成生物工程研究所。实验用水为三重蒸馏水。
1.2 仪器XTY-2探索运动实验仪，中国医学院药物研究所；80-2B离心机，上海安亭科学仪器厂； FSH-2内切式组织可调高速匀浆器，江苏环保仪器厂；721分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；二列六孔电热恒温水浴锅：北京精科华瑞仪器有限公司。
1.3 动物昆明种小鼠120只，体重 28～30g，均为雄性，由中国医学科学院北京药物研究所提供。
2 方法
2.1 分组每项实验均取健康小鼠60只，均为雄性，随机分为5组：假手术组（进行手术但不进行缺血再灌注）、模型对照组(缺血再灌注组)、大黄酚高剂量组、中剂量组和低剂量组（高、中、低剂量分别为10，1，0.1 mg·kg-1，ip）。
2.2 小鼠脑缺血再灌注模型的制备3.5%水合氯醛（10 ml·kg-1, ip）麻醉小鼠后，仰卧位固定，颈部正中切开皮肤约７mm，分离两侧颈总动脉，按Himori法［3］埋线后缝合切口。术后48 h将颈下部两端丝线拉紧,阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态，5 min后轻拉两耳后引线，使颈总动脉恢复血液再灌注。
2.3 探索运动探索运动实验箱，是检测动物行为的场所，由一个暗室和两个明室组成，该设备中装有传感系统，可以接受动物的活动行为信号并传送到机。手术后48 h将小鼠放入探索运动实验仪内进行预选，在箱内自由活动3 min，3 min内不进入暗室者剔除。将经过预选的小鼠进行分组。 除假手术组外，其余各组使脑立即缺血5 min，然后恢复血流。其中大黄酚高、中、低剂量组于缺血前30 min 分别ip大黄酚10，1，0.1 mg·kg-1。24 h后进行探索实验，首先将小鼠放在前面的明室中，点击实验开始，同时打开箱门，当小鼠钻进暗室时，则关上门断其后路。记录小鼠到达暗室时间、到达高端时间、到达明室时间（指后面的明室）；小鼠在暗室滞留时间、小鼠在明室滞留时间（指后面的明室）、小鼠爬高端的次数。
2.4 小鼠全血中GSH-Px活力和血浆中SOD活力测定将术后小鼠分组，模型对照组和大黄酚组均于手术后48 h阻断血流5 min，其中大黄酚高、中、低剂量组于阻断血流前30 min 分别ip大黄酚10，1，0.1 mg·kg-1。恢复血供后10 min，将小鼠的颈动脉切开取血,肝素抗凝，将抗凝全血用三蒸水制成1%溶血液，以GSH-Px试剂盒测定小鼠全血中GSH-Px活力。规定：每4 μl全血在37℃反应5 min，扣除非酶促反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol·L-1为一个酶活力单位。取上述抗凝全血离心（4 000 r·min-1，离心10 min）后取血浆10 μl，采用羟胺法以SOD试剂盒测定。规定：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。
2.5 统计学方法
应用SPSS11.0统计软件进行统计，数据资料用t检验，并进行方差分析，以±s表示。
3 结果
3.1 大黄酚对脑缺血再灌注小鼠探索运动实验中到达暗室时间、到达高端时间、到达明室时间、爬高端次数的影响
脑缺血再灌注后可造成小鼠明显的探索认知行为功能障碍。和假手术组相比，模型对照组小鼠到达暗室时间、到达高端时间、到达明室时间均明显延长（P<0.01），小鼠爬高端的次数明显减少（P<0.01）。预先给予大黄酚，则高、中剂量的大黄酚对脑缺血再灌注小鼠所致探索认知行为功能障碍有明显的改善作用。结果见表1。表1 大黄酚对脑缺血再灌注小鼠在探索运动实验中认知探索功能的影响（略）
3.2 大黄酚对脑缺血再灌注小鼠探索运动实验中在暗室滞留时间和在明室滞留时间的影响
根据实验技术指标的比较要求,只在同一组内进行这两项指标比较。结果表明，模型对照组和大黄酚低剂量组的小鼠在暗室滞留时间和在明室滞留时间有明显差异（P<0.001），而假手术组，大黄酚高、中剂量组在暗室滞留时间和在明室滞留时间无明显差异（P＞0.05），说明高、中剂量的大黄酚对脑缺血再灌注小鼠所致探索认知行为功能障碍有明显的改善作用。结果见表2。表2 大黄酚对脑缺血再灌注小鼠在探索运动实验中认知探索功能的影响（略）
3.3 大黄酚对脑缺血再灌注小鼠全血中GSH-Px活力和血浆中SOD活力的影响
脑缺血再灌注后小鼠全血中GSH-Px活力和血浆中SOD活力明显降低（P<0.01）；高剂量大黄酚对脑缺血再灌注小鼠全血中GSH-Px活力明显提高（P<0.01），高，中剂量的大黄酚对脑缺血再灌注小鼠血浆SOD活性明显提高（P<0.01）。结果见表3。表3 大黄酚对脑缺血再灌注小鼠全血GSH-Px和血浆SOD 的影响（略）
4 讨论
探索是人类在长期的认识和改造自然过程中所形成的一种高级神经活动，探索实验是行为学实验中很重要的实验方法，体现认知能力，从多方面寻求答案，解决疑难问题，更好地适应环境。实验中发现，脑缺血再灌注损伤的小鼠表现出明显的探索认知行为功能障碍。而脑缺血前给予大黄酚后，则对脑缺血再灌注小鼠所致探索认知行为功能障碍有明显改善作用，小鼠到达暗室时间、到达高端时间、到达明室时间缩短，爬高端的次数明显增加（P<0.05）。对于小鼠在暗室滞留时间和在明室滞留时间的比较，根据实验技术指标的比较要求,只在同一组内进行这两项指标的比较，小鼠在暗室滞留时间和在明室滞留时间越相近，说明小鼠认知探索功能越强；本实验结果表明，高、中剂量的大黄酚组在暗室滞留时间和在明室滞留时间无明显差异（P＞0.05），而模型对照组小鼠在暗室滞留时间和在明室滞留时间有明显的差异（P<0.001），进一步说明大黄酚对脑缺血再灌注小鼠所致探索认知行为功能障碍有明显改善作用，另外，低剂量大黄酚组的小鼠在暗室滞留时间和在明室滞留时间有明显的差异，说明大黄酚作用有剂量依赖性。
痴呆是一种临床综合征，主要表现为记忆、认知、语言和行为障碍及人格改变等，老年期发生的痴呆为老年性痴呆，其又分阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和血管性痴呆(vascular dementia, VD)，严重地影响着人类的生活［4］。血管性痴呆是指各种脑血管病引起脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征,为慢性进行性疾病,主要与缺血性脑血管病有关。多灶性梗死是导致血管性痴呆的重要病因［5］。本实验采用小鼠脑缺血再灌注血管性痴呆学习记忆障碍模型,观察了大黄酚对模型小鼠探索功能的影响, 脑缺血再灌注的小鼠有明显的探索认知行为功能障碍，而脑缺血前给予大黄酚后，则对小鼠所致探索认知行为功能障碍有明显改善作用，提示大黄酚有益智作用，可提高认知探索能力，有可能开发成为VD的新型药物，可能降低血管性痴呆的严重程度或减少血管性痴呆的发生，有助于改善缺血性脑血管病的预后。
脑缺血再灌注损伤与兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、自由基的生成、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。脑缺血再灌注损伤的保护机制和药物治疗的研究近年来一直是国际生物医学界关注的一个焦点，研究认为［6］脑缺血对机体是一种严重的应急反应，对脑缺血这一严重应急反应，机体必然存在着一种内源性的抗缺血损伤的体系，包括热休克蛋白70（HSP70）的作用、兴奋与抑制性神经递质的影响、腺苷及其受体的作用、一些细胞因子的作用和抗氧化酶的作用。体内抗氧化酶主要有SOD和GSH等。脑缺血时，大量的自由基产生，引起脂质过氧化损伤，抗氧化酶具有清除氧自由基、抗脂质过氧化损伤、从而对神经细胞产生保护作用。本实验研究结果表明，大黄酚能够提高血液中SOD和GSH-PX的活力，提示大黄酚抗缺血损伤，改善认知探索功能的作用机制可能是通过增强抗氧化酶GSH-PX和SOD活力来进行作用的，其确切机制将在以后系列实验中作进一步研究。
【】
［1］张丹参，张 力. 大黄酚对大鼠肝过氧化脂质含量的影响［J］.张家口医学院学报,1999，16（1）：1.
［2］王树，薛贵平，张丹参. 大黄酚对大鼠脑过氧化脂质含量的影响［J］.张家口医学院学报, 2000，17（3）：4.
［3］Himori N, Watanabe H, Akaike N, et al. Cerebral ischemia model with conscious mice: involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability［J］.J Pharmacol Meth, 1990,23:311.
［4］朱兴族，罗质璞.神经药新论［M］.北京：人民卫生出版社，2004：53.
［5］Volpe BT，Petito CK. Dementia with bilateral medial temporal lobe ischemia［J］.Neurology, 1985,35:1793.
［6］朱桂荣，潘家祜. 脑缺血损伤的内源性保护机制［A］.2004药理学进展［M］.北京：人民卫生出版社，2004：46.
