清毒片、养正片对白血病细胞u?PA活性影响的研究

【摘要】  ［目的］观察中药清毒片、养正片对白血病细胞u?PA活性的影响。［方法］SD大鼠24只，随机分为4组：空白组用生理盐水，清毒片组用清毒片，养正片组用养正片灌胃,化疗组用阿糖胞苷腹腔注射，观察含药血清对HL?60 u?PA活性的影响。［结果］与空白对照组相比较，阿糖胞苷和清毒片、养正片药物血清对HL?60细胞培养液上清中u?PA的活性都有一定程度的影响，而以阿糖胞苷含药血清降低u?PA活性的效果较好。［结论］清毒片、养正片的临床作用可能与其降低患者体内白血病细胞u?PA活性表达水平的作用有关。

【关键词】  清毒片；养正片；白血病；HL?60；u?PA

　　Abstract： ［Objective］We observed the effect of Qingdupian and Yangzhengpian on the u?PA expression in leukemia cells.［Method］248 SD rats weigh (210±20)g,half male and half female,divided into 4 groups randomly: blank control（0) group,Qingdupian（Q) group，Yangzhengpian（Y) group and Chemotherapy(H) group.Blank control group were fed physiological saline,Q group were fed Qingdupian juice,Y group fed with Yangzhengpian juice,twice a day,3.5 days.H group were injected Ara?c through peritoneum,once a day,4 times in all.Draw blood of rats 1～2 hours after the last feed,extract the serum,and store the serum at 4℃.Treat the cells with RPM1640 containing 10% every kind of serum for 48 hours,precipitate the cells;the supernatant fluid was collected respectively for ELISA essay to test the activity of u?PA.［Result］The laboratory research showed that all the serum had inhibitive effect on u?PA activity of the supernatant fluid of HL?60 cells,and Ara?c containing serum had the best effect on declining u?PA activity.［Conclusion］Suggest the clinical therapeutic effect of Qingdupian and Yangzhengpian be related to its declining effect on u?PA activities of leukemia cells.

　　Key words: Qingdupian;Yangzhengpian;Leukemia;HL?60;u?PA

　　1  实验材料

　　1.1  实验材料  清洁级SD大鼠24只（购自广州中医药大学实验动物中心），人早幼粒白血病细胞株HL?60（购自中山医科大学实验动物中心），清毒片、养正片生药饮片各1剂(购自广州中医药大学第一附属),10%胎牛血清（购自杭州四季青公司），完全RPMI?1640培养液(sigma 公司产品)，uPA活性检测ELISA试剂盒（Chemicon International,Inc.产品），计数板，盖玻片，96孔板，加样枪，可处理吸头，一次性注射器，试管，Ep管，玻璃毛细管，灌胃针头，血分析用抗凝管、烧杯等。

　　1.2  实验仪器  倒置显微镜（Olympus产品），细胞培养箱（NAPCO Series 5400 CO2 Incubator），-20℃冰箱（HUALING BCD?268WA）、离心机（上海产TDL?5型），电热恒温水温箱（上海跃进医疗器械厂），全自动酶标仪(BIO?RAD Model 3550)，干燥皿，解剖台，高压锅，电炉等。

　　2  实验方法

　　2.1  分组与用药  将清毒片、养正片生药饮片用水煎浓缩法处理备用。制备清毒片、养正片药物血清(在广州中医药大学实验动物中心进行)。分组：清洁级SD大鼠24只,体重210±20g，雌雄各半，随机分为4组：空白（O）组，清毒片（Q）组，养正片（Y）组，化疗（H）组。方法参照中药血清药理相关［1］。
   
　　各组分别用相应药物灌胃3.5d，2次/d。用药如下：O组用生理盐水2ml，Q组用清毒片口服液2 ml（9g/kg），Y组用养正片口服液2ml（10g/kg），H组用阿糖胞苷1ml（17.85mg/kg）腹腔注射，1次/天，共用4次。于最后一次灌胃后1～2 h将大鼠用乙醚麻醉，毛细玻璃管双眼球后动脉取血2ml置抗凝管中。将样本3000rpm/min离心10min取血清1 ml，置56℃灭活30min，4℃冷藏备用。给药方法及剂量参照血清药理有关研究文献及实验动物用药剂量换算表［2?3］
　　
　　2.2  细胞培养  人早幼粒白血病细胞株HL?60，用完全RPMI?1640培养液加10%胎牛血清培养，置37℃，5%CO2培养箱，3～5d换液1次，倒置显微镜观察，待细胞生长旺盛（达指数生长期）后进行下一步实验［4］。

　　2.3  含药血清处理细胞［1］  取生长良好的HL?60细胞，离心后弃上清，用RPMI?1640培养液稀释混匀，计数后按每孔200μl，密度5000/孔（细胞浓度为2.5×104/L）铺板，同步培养24h，每孔加入含各组含药血清的RPMI?1640培养液200μl，使含药血清的浓度为10%，每个浓度设3个复孔,刺激48 h后分别沉淀各组细胞，取上清液进行u?PA活性的ELISA检测。

　　2.4  细胞u?PA活性的ELISA测定（根据试剂盒说明书操作）  向96孔反应板中分别加入40ul u?PA含药血清样本、空白对照上清液或u?PA阳性对照,添加足够的去离子水使总体积为160μl。然后按试剂盒说明书进行操作，终止反应后立即在全自动酶标仪上405nm波长读取光密度值。

　　2.5  统计分析  以u?PA活性测定试剂盒中所提供的6个浓度的u?PA阳性标准品的浓度为横坐标，各浓度标准品所对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，依据标准曲线确定各浓度含药血清组OD值所对应的u?PA活性水平。运用Excel统计软件，采用计量资料的t检验对各组药物血清处理细胞上清的u?PA活性对应OD数值进行比较。

　　3  实验结果
   
　　实验结果显示，与空白对照组相比较，阿糖胞苷、清毒片和养正片药物血清对HL?60细胞培养液上清中u?PA的活性都有一定程度的影响，而以阿糖胞苷含药血清降低u?PA活性的效果最好，清毒片含药血清次之。各组u?PA活性对应光密度值变化情况见下表1。

　　表1  清毒片、养正片药物血清对u?PA活性的影响（略）

　　与空白组对比，*P<0.05，与空白组对比，**P<0.01

　　4  讨论
   
　　u?PA是一种丝氨酸蛋白水解酶，参与纤溶过程。一些研究发现，培养的白血病细胞中有纤溶活化剂（PAs）的高表达。用HL?60细胞作为AL细胞的模型研究细胞周围基质降解，证实丝氨酸蛋白酶以尿激酶前体的形式存在，基质金属蛋白酶9（MMP?9）前体的活化依赖于纤溶酶原活化剂/纤溶酶系统，并可被抑肽酶抑制，而MMP?9只在HL?60细胞存在的条件下检测到。结果表明HL?60细胞通过纤溶系统活化MMP?9，而MMP?9的活化促进了基质降解，增强了白血病细胞的侵犯能力［5］。AML患者TFPI、PAP值异常增高。后TF、TAT在AML患者中维持高水平；u?PA、u?PAR在未缓解者持续增高；出血严重者PAP、u?PA显著升高。得出结论u?PA、u?PAR可作为部分AML预后判断的指标［6］。急性髓性白血病（AML）患者骨髓和血浆中u?PA的浓度均高于正常人，并且发现白血病细胞主要表达u?PA，而不产生t?PA［7］。
   
　　清毒片和养正片分别由清热解毒及扶正固本的中药组成，是广州中医药大学附属第一血液科专家制定，并长期用于各型白血病患者的中药复方制剂。在临床上，对于患者病情缓解和改善生存质量起到了良好的作用。本实验研究从含药血清作用方面，探讨了清毒片、养正片在体外对人急性早幼粒白血病细胞系HL?60生长状态及u?PA活性的影响，以便与临床研究结合起来，更好地解释这两种中药治疗AL的作用。同时更深入地了解AL疾病变化状态及中药作用途径。
   
　　通过u?PA活性测定的ELISA实验，发现清毒片、养正片与阿糖胞苷含药血清，均具有降低HL?60细胞上清中u?PA活性的作用。且随着药物浓度增加，u?PA活性单位OD值逐渐下降，药物浓度与u?PA活性单位OD值二者呈正相关。清毒片、养正片对HL?60细胞具有降低其产生u?PA活性物质的作用。提示这两种药物的药效与其改变白血病细胞u?PA活性的作用有关。

【】
  　［1］ 耿建国.真武汤对人肾小球系膜细胞外基质作用的实验研究［J］.中医杂志，2001，41（11）：686?687.

　　［2］ 杨彦芳，王玉芹.中药复方血清药方法规范化探讨［J］.中西医结合杂志,2000,20(5): 380?381.

　　［3］ 石岩，梅世昌.医学动物实验手册［M］.中国农业出版社，21?30.

　　［4］ 章静波.组织细胞培养技术［M］.北京：人民卫生出版社，2002：109?1127.

　　［5］ Devy L,Noel A,Baramova E,et al.Production and activation of matrix metalloprotease?9（MMP?9) by HL?60 promyelocytic leukemia cells［J］.Biochem Biophys Res Commun 1997，238(3):842?6.

　　［6］ 吴方，王学锋，璩斌，等.止、凝血分子标志物检测在急性白血病诊治中的意义［J］.中华血液学杂志，2001，22（3）：141?144.

　　［7］ 陈怡，俞康，江松福.纤溶酶相关蛋白在急性髓性白血病血浆和骨髓中的表达［J］.临床血液学杂志，2000，13（1）：26?28.