穿心莲内酯对不同分化胃癌细胞株的体外增殖的影响
作者：董建华 叶再元 李曙光 陶厚权 杨琼
【摘要】 ［目的］明确穿心莲内酯对不同分化胃癌细胞株的体外增殖的影响。［方法］以不同浓度的穿心莲内酯处理低分化(MKN45)、中分化 (SGC7901)和高分化（MKN28）胃腺癌细胞株，分别温育24h 、48h 、72h；采用噻唑蓝比色法检测各和穿心莲内酯对癌细胞的药物半数抑制浓度(IC50 )，比较穿心莲内酯对不同分化胃癌细胞株的体外增殖抑制作用的异同。［结果］穿心莲内酯对胃癌细胞株MKN45、SGC7901、MKN28的体外增殖均具有显著的抑制作用，并且呈剂量效应和时间效应关系。低分化的MKN45细胞株对穿心莲内酯的敏感性明显高于高分化的MKN28细胞株和中分化的SGC7901细胞株。［结论］穿心莲内酯对不同分化程度的胃腺癌细胞株体外增殖抑制作用不同。
【关键词】 穿心莲内酯；分化程度；胃癌细胞株；敏感性；MTT法
Abstract：［Objective］ To determine the sensitivity of Andrographolide in gastric cancer cell lines in various degrees of differentiation.［Methods］ Three gastric cancer cell lines including MKN45(1ow degree differentiation)，SGC7901(moderate degree differentiation) and MKN28 (high degree differentiation) were incubated with Andrographolide of various concentration at 24 hours，48 hours，72 hours.The optial density （OD）value of each group was examined by MTT test；compute the data to arrive at inhibition ratio（IR）and 50% inhibiting concentration ( IC50 )，make the sensitivity disparity clear by compare the data.［Results］ Andrographolide had significant inhibition effects on the proliferation of MKN45，SGC7901 and MKN28 cells in vitro,in a time—dependent and dose—dependent way.Poorly differentiated gastric cancer cell line MKN45 is more sensitivity to chemotherapy than well differentiated MKN28 and moderately differentiated SGC7901.［Conclusion］ The effect of Andrographolide on gastric cancer cells in various degrees of differentiation were different.
Key words:Andrographolide； degrees of differentiation；gastric cancer cell1ines；sensitivity；MTT method
穿心莲内酯（Andrographolide）是爵床科植物穿心莲（Andrographis paniculata（Burm.f.）中提取到的二帖内酯类化合物，分子式是C20H30O5，是中药穿心莲的重要有效成分之一。具有抗菌、抗炎、抗病毒、免疫调节、脑血管疾病、保肝利胆等作用，并具有低毒性、价格便宜的特点。以往研究表明，穿心莲内酯对乳腺癌MCF?7细胞、食管癌Ec9706细胞、结肠癌HCT?8和HCT?l16细胞、前列腺癌PC?3等肿瘤细胞，均有体外抗肿瘤作用。穿心莲内酯能抑制多种肿瘤细胞系的增殖［1］。但对胃癌细胞的作用未见报道。本研究通过体外细胞培养采用MTT法明确穿心莲内酯对高分化胃癌细胞株MKN28、中分化胃癌SGC7901、低化胃癌细胞株MKN45的体外增殖的影响，以期揭示穿心莲内酯对不同分化胃癌细胞的作用，为临床治疗胃癌用药提供实验依据。
1 实验材料
1.1 主要实验药品 穿心莲内酯（药品生物制品检定所 用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成100mg/ml的溶液，-20℃保存备用），RPMI?1640培养液（美国Gibco公司 加入青霉素和链霉素，使其浓度分别为100U/ml和100μg/ml），胎牛血清（北京鼎国生物技术公司 56℃灭活30min,-20℃保存备用），0.1MPBS液，胰酶（美国Gibco公司），DMSO（无锡海硕生物有限公司)， 噻唑蓝（MTT，美国Genview公司 用无血清RPM1640 培养液配成1mg/ml）。
1.2 主要实验仪器 96孔培养板（德国Greiner公司），超净工作台（苏州苏净集团安泰公司），二氧化碳孵育箱（德国 Thermo公司），自动酶标仪（瑞士Tecan 公司）。
1.3 试验用细胞 人高分化胃癌细胞株MKN28、中分化胃癌株SGC7901、低化胃癌细胞株MKN45，均由自上海大学消化外科实验中心惠赠。
2 实验方法
2.1 细胞培养 将3种细胞用含有10%小牛血清的RPMI1640 培养液,于37℃、5% CO2 的培养箱中培养,每2～3d 传代1 次,取对数生长期细胞用于实验。
2.2 实验分组 实验分为穿心莲内酯实验组、5?氟脲嘧啶（5?FU）对照组、阴性对照组、DMSO对照组和空白对照组。其中穿心莲内酯实验组包括7.5μg/ml、15μg/ml 、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml 共5个浓度组，每组设3个复孔；5?FU对照组、阴性对照组、DMSO对照组、空白对照组每组各设5个复孔。
2.3 MTT 法测定细胞OD值 以中分化胃癌珠SGC7901为例说明具体操作。取三块96 孔板，将SGC7901对数生长期细胞进行消化制成细胞悬液，调整细胞密度接种于96 孔板对照组（空白组除外）和实验组各孔,每孔加细胞悬液200μl含细胞4×103 个。将培养板置于37℃含5% CO2 的培养箱中孵育12h,观察细胞贴壁良好后弃去培养基。将实验组加入含不同浓度穿心莲内酯的培养基200μl； DMSO组和5?FU组各孔分别加入含0.2%DMSO和15μg/mL 5?FU的培养基200μl；阴性对照组加不含药物培养基200μl；空白组各孔加入与对应实验组等药物浓度的培养基200μl，作自动酶标仪调整OD值用。将三块细胞培养板放入培养箱中孵育。于孵育24h时取出其中一块细胞培养板，每孔加20μl MTT；37℃温育4h ；取出细胞培养板,吸弃培养基，每孔加入150μl DMSO， 用微量振荡器振荡10分钟；酶标仪选择检测波长570nm，波长630nm，以570 nm-630 nm作为最终每孔OD值。另两块细胞培养板分别于孵育48h、72h时各取一块加入MTT并测值，方法同上。实验重复3次。其他两种细胞实验操作方法同SGC7901细胞系。
2.4 统计学处理 使用SPSS软件进行数据处理。应用单因素方差分析进行每种细胞的浓度梯度之间、时间梯度之间以及三种细胞IC50之间的比较。每组数据比较之前均进行q检验和levene方差齐性检验。
3 结果
3.1 阴性组和DMSO组的比较 不同分化细胞系24h、48h、72h时间段阴性组和0.2% DMSO组OD值比较,见表1。
表1 各组实验中阴性组和DMSO组OD值均数（略）
与阴性照组,*P<0.05
3.2 穿心莲内酯对不同分化胃癌细胞系的体外增值抑制作用与其浓度和作用时间的关系 见表2～表4。
表2 穿心莲内酯对MKN45 细胞的增殖抑制作用（略）
与阴性照组比较,*P<0.05 vs；相同时间与前一浓度组比较,#P<0.05；相同浓度与24h比较比较，△P<0.05；相同浓度与 48h比较,□P<0.05
表3 穿心莲内酯对SGC7901细胞的增殖抑制作用（略）
与阴性照组比较,*P<0.05 vs；相同时间与前一浓度组比较,#P<0.05；相同浓度与24h比较比较，△P<0.05；相同浓度与 48h比较,□P<0.05
表4 穿心莲内酯对MKN28细胞的增殖抑制作用（略）
与阴性照组比较,*P<0.05 vs；相同时间与前一浓度组比较,#P<0.05；相同浓度与24h比较比较,△P<0.05；相同浓度与 48h比较,□P<0.05
3.3 三种胃癌细胞系对穿心莲内酯敏感性的比较 见表5,图1
表5 穿心莲内酯对MKN45、SGC7901 MKN28的IC50值（略）
图1 三种细胞IC50均数比较（略）
4 讨论
化疗药物对肿瘤细胞的作用主要在于抑制细胞增生和诱导细胞凋亡，其总的表现即是对肿瘤细胞的增殖抑制。IR的大小，表示了化疗药物对肿瘤细胞毒性的大小，也表示了化疗药物肿瘤效价的高低。由等比浓度药物的IR可以出药物的IC50，IC50是衡量肿瘤细胞对化疗药物敏感性的重要指标，IC50 值越小表示肿瘤细胞对化疗药物的敏感性越大；反之则表示敏感性越小。本实验以0.2%的DMSO培养胃癌细胞作为对照，实验结果显示0.2%浓度的DMSO对MKN45、SGC7901和MKN28体外增殖无影响。本实验用DMSO溶解穿心莲内酯，在各实验组中DMSO最高浓度不超过0.12%，因此对细胞增殖无影响，实验结果可靠。
实验显示，穿心莲内酯对不同分化程度胃腺癌细胞均有明显的增值抑制作用，说明穿心莲内酯对胃癌细胞具有很好体外的抗肿瘤作用。其IR随剂量的增大而增大、随作用时间的延长而升高，抗胃癌作用具有剂量效应和作用时间效应。实验还显示，低分化MKN45胃腺癌细胞株对穿心莲内酯敏感性最高，高分化MKN28胃腺癌细胞株对穿心莲内酯敏感性最低，中分化的SGC7901细胞对穿心莲内酯的敏感性略低于MKN28胃腺癌细胞株且统计显示两者无区别，说明不同分化肿瘤细胞对穿心莲内酯敏感性不同，胃癌细胞对穿心莲内酯敏感性与其组织分型有关联。穿心莲内酯对分化较好的胃癌细胞系不敏感而对分化差的肿瘤细胞敏感，呈现高分化低敏感性，低分化高敏感性的趋势，这与一些学者所研究的其它种类的化疗药物结果［2］不一致。肿瘤细胞分化程度越差，对穿心莲内酯的敏感性越高。这也正说明穿心莲内酯在抗胃癌作用方面的优势所在。
【】
［1］ 李曙光,叶再元.穿心莲内酯的药理活性作用［J］.中华中医药学刊,2008，6（5）：984?986.
［2］ 王崇树，魏寿江，赵国刚，等.病理类型与化疗药物敏感性的关系研究［J］.国外医学.临床生物化学与检验学分册，2005，26(4)：209.
