腺病毒介导存活素RNA干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用

                作者：谢富华,王润秀,李莉萍，覃燕梅，梁念慈

【摘要】  目的： 研究腺病毒介导的RNA干涉（RNA interference, RNAi）沉默存活素（Survivin）表达后，对MCF?7细胞裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑制作用. 方法： 构建携带survivin shRNA表达质粒的腺病毒Ad?survivin，并检测其滴度；建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型；将重组腺病毒悬液行瘤周和瘤体注射，观察肿瘤生长情况；剥离瘤体称重并药物的抑瘤率；免疫组织化学检测Survivin蛋白表达情况. 结果： 成功建立人乳腺癌肿瘤模型，移植瘤成功率为90%（18/20）；给药后实验组移植瘤的生长速度慢于对照组；病检查为浸润性导管癌；剥离肿瘤组织称重发现实验组抑瘤率为28.89%（P<0.05）；免疫组化发现实验组Survivin蛋白表达区的吸光度值为（15.63±1.54），明显低于阴性对照组（30.45±6.72）和空白对照组（30.25±6.58），差异均有统计学意义（P<0.05）. 结论： 以腺病毒为载体，以survivin基因为靶点RNAi介导的基因方法有望成为乳腺癌一种新的治疗策略.

【关键词】  RNA干扰; 存活素（survivin）; 重组腺病毒；裸鼠；基因治疗

     0引言

    存活素（Survivin）作为一种凋亡抑制蛋白，通过多条细胞信号传导通路抑制细胞凋亡，除了Wnt，FOXM1等通路可能参与乳腺癌Survivin蛋白的调控外［1-2］，尚有许多细胞因子如VEGF，p27，Stat?5等也与Survivin蛋白相关［3-5］. 目前，应用RNA干扰技术、核酶技术、反义核苷酸技术等进行的靶向survivin基因治疗研究，大多为体外实验，而在体内对肿瘤的生长抑制作用的研究还少见报道. 本研究在建立乳腺癌动物模型的基础上，以Survivin蛋白为靶点，通过RNAi技术和重组腺病毒技术，对乳腺癌的基因治疗进行体内研究，以期通过观察肿瘤生长抑制情况，探索肿瘤基因治疗的新途径，为实现抗乳腺癌生长与转移提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料Blal/b?nu/nu雌性裸小鼠20只，4～6 wk龄，体质量17～22 g（广东医学院实验动物中心；MCF?7细胞（广东医学院分子生物学实验室保存）；HEK?293细胞（院上海细胞研究所）；胎牛血清（杭州四季青公司）；RPMI 1640培养液（美国Gibeo公司）；腺病毒包装试剂盒（美国ambion公司）；小剂量腺病毒纯化试剂盒（广州展晨生物技术有限公司）；免疫组织化学检测试剂盒，Survivin mAb（北京中杉金桥生物技术有限公司）.

    1.2方法

    1.2.1重组腺病毒的构建与纯化将前期实验中构建的survivin shRNA表达质粒和阴性对照质粒，按pSilencer adeno 1.0?CMV试剂盒与腺病毒纯化试剂盒说明书构建并纯化重组腺病毒,分别命名为Ad?survivin和Ad?control.

    1.2.2重组腺病毒滴度测定采用［6］的微量全细胞病变法检测病毒滴度. 取96孔板，每孔加入1×104 HEK?293细胞，加培养液200 μL，置孵箱培养24 h. 待测病毒用DMEM全培养基稀释至10-2，10-3，10-4，10-5，10-6及10-7的稀释度病毒液体，吸去上清后，分别加入每个稀释度的病毒液体，每孔200 μL，每孔均设复孔，同时设培养基对照(不含腺病毒). 37℃，50 mL/L CO2条件下继续培养36～48 h. 镜下观察完全细胞病变现象，按以下公式计算滴度. 滴度（pfu/mL）=（接种细胞数×稀释度×10）/加入的病毒体积（mL）.

    1.2.3人乳腺癌模型的建立按照文献［7］的方法，将MCF?7细胞0.1 mL(1×1010～5×1010细胞/L)接种于裸鼠右前肢腋下，待瘤径达0.5 cm左右时随机分组，每组6只. 瘤内及瘤周同时注射0.1 mL Ad?survivin，Ad?control或PBS［参照文献［8-9］的方法，病毒量为1×108 pfu/（只·次）］，1次/3 d，共9次. 用游标卡尺测量瘤体长径（a）和短径(b)，按公式计算移植瘤体积. 移植瘤体积（V，mm3）=πab2/6计算，观察3 wk，绘制生长曲线.

    1.2.4标本采集及瘤组织病理学观察药物处理结束后3 d，脱颈椎处死裸鼠，剥出肿块称重，参照文献［10-11］的方法，按公式计算抑瘤率. 抑瘤率（%）=（1-实验组瘤重/对照组瘤重）×100%. 切取肿瘤、肺脏和肝脏组织制备组织切片，HE染色后采用光镜观察并分析.

    1.2.5免役组织化学检测按SP法要求，对肿瘤组织中Survivin蛋白的表达情况进行检测. 结果判断标准：以染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞，并通过Motic医学图像分析系统比较三组图片中棕黄色或棕褐色区域的累积吸光度值（每组各选10视野分析）.

    统计学处理：采用SAS8.1统计软件进行统计学分析，实验结果以x±s表示，采用完全随机设计方差分析，比较各组肿瘤重量及免疫组化结果. P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1重组腺病毒的滴度接种腺病毒后36～48 h，观察到在10-2，10-3，10-4稀释度的样本中293细胞出现完全细胞病变现象，如：细胞变圆变大，帖壁能力降低，并聚集成葡萄状等，以最低稀释度（10-4）代入公式中计算，腺病毒滴度约为5×109 pfu/mL.

    2.2移植瘤生长情况接种乳腺癌MCF?7细胞株后11 d，于接种处可见微小突起，以后逐渐明显. 接种后17 d，有18只裸鼠移植瘤体积均超过100 mm3，接种成功率为90%. 接种后17，20，23，26 d，Ad?survivin组的移植瘤体积与Ad?control组和PBS组的无明显区别. 接种后29 d，Ad?survivin组的移植瘤体积（210.59±4.25） mm3小于Ad?control组（365.04±14.13） mm3和PBS组（412.2±8.90） mm3，但三组间的差异无统计学意义（P>0.05）. 接种后32 d，Ad?survivin组的移植瘤体积（288.02±5.22） mm3明显小于Ad?control组（516.08±11.79） mm3和PBS组（625.25±50.95） mm3，差异均有统计学意义（P<0.05，图1）.

    图1给药后各组肿瘤生长曲线

    2.3移植瘤组织病观察移植瘤呈椭圆形或分叶状生长（图2），质地硬，切面灰白. 光镜下可见移植瘤细胞形状不规则，大小不均一，核大浓染，核异形性明显，有病理性核分裂像，核浆比例明显增大. 各组裸鼠的肝、肺脏组织未见损伤和瘤细胞转移（图3）.

    2.4siRNA药物的抑瘤作用接种后35 d处死裸鼠，剥离瘤体称重发现：Ad?survivin组瘤体质量为（0.32±0.04） g，低于PBS组（0.45±0.06） g和Ad?control组（0.41±0.06） g，其差异具有统计学意义（P<0.05），表明Ad?survivin组肿瘤细胞增殖受到抑制，抑制率为28.89%；而Ad?control组和PBS组间的差异无统计学意义（P>0.05）.

    2.5移植瘤组织Survivin蛋白表达免疫组化结果显示（图4），Survivin抗原表达于移植瘤细胞质内，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色. Motic医学图像分析各组棕黄色或棕褐色区域的累积吸光度值，Ad?survivin组为（15.63±1.54），低于PBS组（30.45±6.72）和Ad?control组（30.24±6.58），其差异具有统计学意义（P<0.05）. 表明Ad?survivin组肿瘤细胞中Survivin蛋白表达受到抑制；而Ad?control组和PBS组间的差异无统计学意义（P>0.05）.

    3讨论

    Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用. 以survivin基因为靶点的RNAi研究最早报道于2003年，Carvalho等［12］用siRNA转染HeLa细胞，60 h后采用Western Blot检测不到Survivin蛋白的表达，细胞增殖明显受到抑制，部分细胞出现凋亡. 随着RNAi技术的不断完善，由原来直接导入外源的siRNA，到真核表达载体转录产生siRNA，以及用于RNAi的病毒载体的出现，大大提高了转染效率和干扰效率. Cheng等［13］用针对survivin基因的RNAi真核表达载体转染肝细胞癌SMMC?7721细胞，发现转染细胞中几乎没有survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M期细胞比例减少，细胞增殖减慢. 如今针对survivin基因的RNAi研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果，但体内研究的报道尚不多见.

    本研究选用BALB/C遗传背景的裸鼠作为体内移植肿瘤的动物模型，成瘤后见肿瘤细胞呈条索状生长，细胞形状不规则，大小不均一，核大浓染，核异形性明显，可见病理性核分裂像，核浆比例明显增大，表明所建立的动物模型符合实验要求. 然后应用腺病毒介导的RNAi 技术对瘤体及瘤周进行注射观察其抑瘤效果. 结果发现实验组肿瘤的生长速度、体积均慢于或低于对照组. 表明经过RNAi封闭后，survivin基因的表达受到抑制，细胞分泌Survivin蛋白的量明显减小，从而减缓或解除了其抑制凋亡的作用，诱导了大量肿瘤细胞凋亡并抑制了肿瘤细胞的增殖活性. 然而，本实验应用RNAi对在体肿瘤的抑制率并不很高，原因除了实验过程中的影响因素外，还有肿瘤的发生发展是一个全身的、多因素的、多基因参与的复杂过程，针对单一基因的RNAi可能对有的肿瘤其抑制效果不很明显，若结合放疗或化疗以及联合其他基因进行，则效果可能会更好.

【】
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