靶向Livin的siRNA提高MDA?MB?231细胞对阿霉素敏感性的可能机制

                   作者：李凡 王小毅 田甜 陈力 李佳 任国胜

【摘要】  目的： 采用RNA干扰技术下调Livin基因的表达，观察其提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性及机制. 方法： 构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDA?MB?231后，通过实时定量PCR，Western Blot技术检测干扰前后Livin和Caspase?3的表达；采用MTT法检测细胞增殖的变化以及细胞对阿霉素的半数抑制浓度（IC50），流式细胞法检测细胞周期，TUNEL法检测其诱导细胞对阿霉素化疗增敏作用，并观察细胞超微结构变化. 结果： 成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体，si?Livin2对Livin的mRNA和蛋白抑制效率最高，分别为76.4%和70.2%，同时Caspase?3的mRNA和蛋白表达升高约157.1%和38.6%（P<0.05）. si?Livin2转染48 h后，与未转染组相比，细胞增殖活力受到抑制，si?Livin2联合阿霉素使细胞周期阻滞于G0/G1期（P<0.05），显著提高了细胞对阿霉素敏感性，其凋亡率达到(38.35±2.64)%，IC50降低为（2.46±0.87） mg/L，差异具有统计学意义（P<0.05）. 透射电镜下可见细胞胞质浓缩，染色质聚集为小团块，密度增高. 结论： 靶向Livin siRNA真核表达载体可以有效地下调MDA?MB?231细胞Livin基因的表达，并且通过上调Caspase?3的表达抑制细胞增殖，显著增强其对阿霉素的敏感性.

【关键词】  乳腺肿瘤；Livin基因；RNA干扰；阿霉素

    0引言

    Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员，它在肿瘤组织中特异性表达并具有强大的抗凋亡作用，已成为肿瘤基因新的靶点［1］. 近年的研究［2］认为，凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方面起着核心作用. 而特异性阻断肿瘤细胞内高表达的Livin基因，可以抑制细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3］，但其化疗增敏作用的发生机制尚不明确. 我们通过构建靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDA?MB?231，观察Livin表达下调对细胞阿霉素化疗敏感性的影响，并探讨其发生的可能机制.

    1材料和方法

    1.1材料人乳腺癌细胞株MDA?MB?231（中科院上海细胞资源中心）；shRNA质粒载体pGeneSil?1（武汉晶赛公司）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；质粒提取试剂盒（美国Omega公司）；总RNA提取试剂、实时定量PCR扩增试剂（大连TaKaRa公司）；兔抗人多克隆抗体Livin（美国Imgenex公司）；兔抗人多克隆抗体Caspase?3，辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司）；TUNEL检测试剂盒（德国Roche公司）.

    1.2方法

    1.2.1靶向Livin的siRNA真核表达载体的构建利用Ambion公司在线设计程序，针对GenBank中Livin（No.NM?022161，No.NM?139317）的共同序列，筛选出三条干扰序列，即siRNA1：5′?CTGGCCTCCTTCTATGACT?3′；siRNA2：5′?GGAAGAGACTTTGTCCACA?3′；siRNA3：5′?CCGTGTCCATCGTCTTTGT?3′；同时设计非特异性靶序列：5′?GACTTCATAAGGCGCATGC?3′. 将化学合成的正义链和反义链退火，与经HindⅢ和BamHⅠ酶切后线性化的pGeneSil?1载体连接，经筛选，酶切鉴定后测序. 所得质粒命名为si?Livin1, si?Livin2, si?Livin3和 si?HK.

    1.2.2MDA?MB?231细胞的培养和转染MDA?MB?231细胞用含100 mL/L胎牛血清、1×105 U/L青霉素和1×105 U/L链霉素的RPMI1640培养液，于37℃，50 mL/L CO2的恒温箱中培养传代. 转染前将细胞接种于6孔板,待细胞生长至密度为70%～90%时，按照LipofectamineTM2000说明书转染重组质粒.

    1.2.3实时定量PCR检测细胞接种于6孔板，分为未转染组，si?HK组，脂质体组，si?Livin1组，si? Livin2组和si?Livin3组. 转染48 h后收集细胞，按照试剂说明书提取细胞总RNA. 以cDNA为模板，进行实时定量PCR反应. PCR扩增条件：95℃ 10 s,1个循环；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环；95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s,1个循环. 引物序列：Livin，上游：5′?CTGGGACCCGTGGGAAGAAC ?3′，下游：5′?TCCTGGGCACTTTCAGACTG?3′；β?actin，上游：5′?TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA?3′，下游：5′?GTAGCCACGCTCGGTCAGGATCTTC ?3′. 以Livin基因与β?actin相对浓度的比值反映Livin表达量. 检测Caspase?3时，实验分为未转染组，si?HK组和干扰Livin效果最强的si?Livin2组. 引物Caspase?3,上游：5′?AGAACTGGACTGTGGCATTGAG?3′，下游：5′?GCTTGTCGGCATACTGTTTCAG?3′. 检测方法同前.

    1.2.4Western Blot检测重组质粒转染48 h后，实验分组同上. 蛋白裂解液提取总蛋白. 用12 mL/L的SDS?PAGE胶垂直电泳分离. 蛋白电转至PVDF膜，封闭后分别加入一抗（1∶500）和辣根酶标记兔二抗（1∶5000），T?BST漂洗后ECL于暗室中曝光和显影.

    1.2.5细胞增殖能力及细胞对阿霉素半数抑制浓度由于si?Livin2组的Livin抑制率最高，故只用si?Livin2进行干预. ① 将细胞分为未转染组，si?HK组和si?Livin2组（后续实验分组相同）. 重组质粒分别转染细胞，培养0,24,48,72和96 h后加入5 g/L MTT 20 μL，37℃避光孵育4 h后加入150 μL DMSO,酶标仪波长490 nm处检测吸光度A值. ② 将不同浓度的阿霉素加入未转染组(即为阿霉素组)和转染48 h后的si?HK组和si?Livin2组（si?Livin2联合阿霉素干预组），各组阿霉素终浓度分别为1，2，4，6，8，10 mg/L，继续培养48 h，MTT法检测各孔A值. 按照公式细胞生长抑制率. 抑制率(％)=(1-转染组A值/未转染组A值)×100％. 以细胞抑制率与阿霉素浓度的数值为依据，求出阿霉素的半数抑制浓度(IC50)值.

    1.2.6流式细胞仪检测细胞周期细胞接种于6孔板，转染48 h后，加入阿霉素（终浓度为4.5 mg/L）继续培养48 h；消化收集细胞，用700 mL/L的冰乙醇4℃固定30 min以上. 去除乙醇，加终浓度50 mg/L的RNaseA，室温静置1 h；加入终浓度为100 mg/L的碘化丙啶（propidium iodide, PI），避光30 min后上机检测.

    1.2.7Tunel法检测细胞凋亡细胞接种于置入了细胞爬片的24孔板，转染48 h后，分别在各组加入PBS和终浓度为4.5 mg/L的阿霉素. 继续培养48 h后按TUNEL试剂盒说明书检测细胞凋亡，胞质呈棕黄色的为凋亡细胞. 每张爬片于高倍镜下随机观察5个视野，以凋亡细胞数除以细胞总数作为细胞凋亡率.

    1.2.8细胞超微结构的观察各组细胞转染重组质粒以及加入阿霉素共培养48 h以后，消化收集各组细胞沉淀,戊二醛固定细胞,染色后进行透射电镜观察.

    统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析. P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1重组质粒的构建和鉴定如图1所示，重组质粒被SalⅠ酶切出一条约400 bp的DNA小带. 三条Livin的干扰质粒和si?HK均符合设计要求. 测序结果均与目的序列相同.

    1: si?HK SalI酶切; 2: si?HK; 3: si?Livin1 SalI酶切; 4: si?Livin1; 5: si?Livin2 SalI酶切; 6: si?Livin2; 7: si?Livin3 SalI酶切; 8: si?Livin3; M: marker.

    图1重组质粒的酶切鉴定

    2.2Livin?siRNA对Livin表达的下调作用转染48 h后，与未转染组比较，Livin表达在si?HK组和脂质体组无明显变化（P>0.05），si?Livin1组，si?Livin2组，si?Livin3组的Livin mRNA和蛋白表达受到不同程度的抑制，其中si?Livin2组的Livin表达抑制最明显，其抑制率分别约76.4%和70.2%（P<0.05，图2）.

    1: 未转染组; 2: si?HK组; 3: 脂质体组; 4: si?Livin1组; 5: si?Livin2组; 6: si?Livin3组.

    图2Western Blot检测Livin表达水平

    2.3Livin?siRNA对Caspase?3表达的影响转染48 h后，未转染组，si?HK组和脂质体组的Caspase?3表达无明显差异（P>0.05），si?Livin2组Caspase?3 mRNA和蛋白相对含量比未转染组升高157.1%和38.6%（P<0.05，图3）.

    1: 未转染组; 2: si?HK组; 3: 脂质体组; 4: si?Livin2组.

    图3Western Blot检测Caspase?3表达水平

    2.4Livin?siRNA对MDA?MB?231细胞增殖以及阿霉素IC50的影响如图4所示，转染si?Livin2沉默Livin表达后对细胞增殖具有抑制作用，si?Livin2组生长曲线较未转染组和si?HK组平缓. si?Livin2组细胞对阿霉素IC50值较未转染组和si?HK组下降显著，分别为（2.46±0.87），(7.13±0.68),（7.24±0.53） mg/L，差异具有统计学意义(P<0.05，图4).

    图4Livin?siRNA对MDA?MB?231细胞增殖的抑制作用

    2.5Livin?siRNA联合阿霉素对MDA?MB?231细胞周期的影响G0/G1期细胞比率阿霉素组细胞与未转染组和si?HK组细胞相比较有所升高（P<0.05）；S期细胞比率降低（P<0.05）；而si?Livin2联合阿霉素干预组细胞周期阻滞于G0/G1期更加显著，差异具有统计学意义（P<0.05，表1）.表1各组MDA?MB?231细胞周期的变化
 
  2.6TUNEL法检测Livin?siRNA增强MDA?MB?231对阿霉素敏感性在单独加入阿霉素干预时，可见到胞质为棕黄色的凋亡细胞，其凋亡率为(21.62±1.38)%，高于未转染组的(2.62±1.18)%（P<0.05）；si?Livin2与阿霉素联合干预后，细胞凋亡率为(38.35±2.64)%，较未转染组和si?HK组的凋亡细胞增加更加显著（P<0.05，图5）.

    2.7MDA?MB?231细胞超微结构的观察透射电镜下观察可见,si?Livin2联合阿霉素组MDA?MB?231细胞胞体缩小，胞质浓缩、胞膜崩解，部分线粒体肿胀，核仁消失、染色质聚集浓缩为数个团块,密度增高. 而未转染组和si?HK组细胞未见此类表现（图6）.

    3讨论

    乳腺癌是一种全身性疾病，化疗在乳腺癌的中占有重要地位. 然而肿瘤细胞对化疗药物的耐受是治疗失败的主要原因. Beurel等［4］证实，细胞对化疗药物敏感或耐受在一定程度上取决于凋亡相关基因的表达状态. Livin基因是凋亡抑制因子家族中的一个重要成员，其抗凋亡并对多种凋亡刺激剂具有抵抗作用［5-6］. 抑制Livin的表达有可能逆转肿瘤细胞耐药，可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.

    RNA干扰是由双链RNA引发的转录后基因沉默，它与特异性mRNA的结合后导致靶基因的降解，高效特异的抑制细胞内基因的表达［7］. 在本实验中，我们构建了Livin siRNA真核表达载体，分别在mRNA和蛋白水平成功阻抑MDA?MB?231细胞中Livin的表达. 这说明选择的靶位点是有效的，通过RNA干扰技术可以有效的抑制Livin在乳腺癌细胞中的表达. 本研究结果显示，经si?Livin2下调Livin表达后，MDA?MB?231细胞的增殖受到明显的抑制；并且与未转染组和si?HK组相比，转染后细胞生长曲线低平，缺乏指数增殖特征. 进一步研究发现肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，对阿霉素诱导凋亡敏感性明显增加，对阿霉素的IC50值显著降低. 这与前期的研究结果相似［8］，表明RNA干扰技术可以有效沉默Livin基因，由此在逆转肿瘤细胞耐药方面发挥重要作用. Livinα和β两个亚基各有一个BIR序列，Livin发挥抗凋亡的机制之一是通过BIR结构域与Caspase?3，7，9结合，抑制后者的活性，从而抑制细胞的凋亡［9］，Caspase?3激活是凋亡信号传导的关键. 本研究结果表明，Livin表达下调可造成Caspase?3的表达量随之升高，提示抑制Livin的表达可能激活Caspase?3依赖的凋亡信号传导通路，从而导致乳腺癌细胞对阿霉素诱导凋亡敏感性增高.

    综上所述，本研究构建的靶向Livin的siRNA真核表达载体可以有效地抑制Livin基因的表达，并通过上调Caspase?3的表达从而抑制细胞增殖，显著提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性，为提高临床乳腺癌治疗效果奠定实验基础.

【】
  ［1］ Liu B, Han M, Wen JK, et al. Livin/ML?IAP as a new target for cancer treatment［J］. Cancer Lett，2007，250(2):168-176.

［2］ 王昊，谭升顺，王新阳，等. siRNA沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响［J］. 第四军医大学学报，2007，28（24）：2235-2238.

［3］ Wang R, Lin F, Wang X, et al. Silencing Livin gene expression to inhibit proliferation and enhance chemosensitivity in tumor cells［J］. Cancer Gene Ther, 2008,15(6):402-412.

［4］ Beurel E, Kornprobst M, Blivet?Van Eqqelpoel MJ, et al. GSK?3 beta inhibition by lithium confers resistance to chemotherapy?induced apoptosis through the repression of CD95(Fas/APO?1) expression［J］. Exp Cell Res, 2004, 300（2）:354-364.

［5］ Crnkovic MI, Muley T, Meister M, et al. The anti?apoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of nonsmall cell lung cancer cells［J］. Lung Cancer,2006,54（2）:135-142.

［6］ Crnkovi? MI, Wagener N, Semzow J, et al. Targeted inhibition of Livin resensitizes renal cancer cells towards apoptosis［J］. Cell Mol Life Sci，2007,64(9):1137-1144.

［7］ Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy［J］. Cancer Gene Ther，2005，12(3)：217-227.

［8］ 刘平，王同杉，游思洪，等. Livin在人胃癌组织中的表达及其沉默后对胃癌细胞凋亡的影响［J］. 中华肿瘤杂志，2007，29（8）：570-574.

［9］ Scott FL, Denault JB, Riedl SJ, et aL. XIAP inhibits caspase?3 And?7 using two binding sites: Evolutionarily conserved mechan?ism of IAPs［J］. EMBO J，2005，24 (3)：645-655.