SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析壳寡糖
作者：王亮,吴昌英, 刘桦 ,张涛
【摘要】 目的 研究一种快速准确的分析壳寡糖组成的定性测定方法。方法 通过连续电泳和不连续电泳对比实验确定壳寡糖的最佳分析条件。结果 浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为17.5%，上样量为10 μl，恒定电流为40 mA，电泳时间50 min条件下，获得最佳壳寡糖分析图谱。 结论 SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳分析壳寡糖组成的方法的确是一种简单快速有效地定性检测方法。
【关键词】 壳寡糖； 电泳分析； 聚丙烯酰胺凝胶电泳
【Abstract】 Objective To explore a qualitative, fast and accurate way for analyzing composition of chitooligosaccharide . Methods By consecutive electrophoresis and non?consecutive electrophoresis experiments, the best analysis conditions of chitooligosaccharide were determined. Results The concentration of plastic was 3 percent, the concentration of separation of plastic was 17.5 percent, the volume of samples was 10 μl, constant current was 40 mA ,electrophoresis time was 50 min. Best analysis photos of chitooligosaccharide Can be obtained under those conditions. Conclusion The method of analyzing composition of chitooligosaccharide is truly a simple,effective, accurate and qualitative way.
【Key words】 chitooligosaccharide；electrophoretic analysis；polyacrylamide gel electrophoresis
壳寡糖是壳聚糖经水解制得的产物，是D?葡萄糖胺通过β?(1?4)糖苷键连接的吡喃葡萄糖键合而成的2～10个单元的低聚糖。报道［1?3］，壳寡糖具有促进脾脏抗体生成、抑制肿瘤生长等生理功能，在食品和日化用品方面也有着广泛的应用。一般壳寡糖的检测多采用薄层层析和高效液相色谱法。对于薄层层析法，虽然价格低廉，但是操作时间长，无法定量，而高效液相色谱法，效果好，但是它需要大型的仪器且流动相，花费昂贵，对于一般的实验室来说初期筛选是不利的。所以需要一种简便快捷低廉检验壳寡糖的方法。本研究使用SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳检测寡糖，快速、简便，弥补了传统检测方法的缺点，具有较好的应用和推广价值。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
寡糖(Sigma)，盐酸氨基葡萄糖（医药集团上海试剂公司），壳聚糖（脱乙酰度≧90%，上海伯奥生物科技有限公司），蜗牛酶（Lvshengyuan Biotechnology公司）,硼氢化腈钠（Fluka），其余试剂均为国产分析纯。
冷冻干燥机(Thermo公司),高速冷冻离心机（Eppendorf公司），pH计(成都方舟科技开发公司),10kD超滤管(Millipore公司), MINI?PROTEIN Ⅳ电泳系统（Bio?Rad公司）,凝胶成像系统(Gene公司)。
1.2 方法
1.2.1 壳聚糖的降解方法
按文献［4］方法，取1%壳聚糖醋酸溶液，加入1 mg/ml的酶溶液，于40℃的水浴锅中反应100 min，煮沸10 min终止反应，加1 mol/L NaOH溶液，4 000 r/min离心5 min，取上清液于10 kD的超滤管中,3 000 r/min离心10 min，收集滤液进行真空冷冻干燥。
1.2.2 标记溶液的制备方法 取邻氨基苯甲酸0.28g,硼氢化腈钠0.63g溶于10ml水中，于65℃水中溶解(该溶液使用前配制)。
1.2.3 样品液的制备方法 按参考文献［5］方法取上述实验步骤得到的冻干样品、盐酸氨基葡萄糖和寡糖各0.01g，分别加入0.2ml已预热的标记溶液，65℃的水浴锅中保温2 h后加入1.2 ml丙酮，于15 000 r/min离心3 min，收集沉淀并加入0.05ml样品缓冲溶液（0.08 mol/LTris?盐酸缓冲溶液，pH6.8+5% SDS +87%甘油+溴酚蓝）,混匀。
1.3 电泳
按参考文献［6］方法分别配制12.5%、15%、17.5%的分离胶和3%的浓缩胶。
加样：取1.2.3制得的样品液10 μl进行SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.4 成像
将电泳后的凝胶在紫外光下成像。
2 结果与电泳图分析
2.1 结 果（见图1、2、3、4）
2.2 电泳图分析
2.2.1 通过与资料［5］对比可知，此实验得到的主要是聚合度为3～7的壳寡糖，与文献［6］采用薄层层析法与液相色谱法分析出的壳寡糖相同。
2.2.2 对比图1、3，随着胶浓度增大，寡糖带越来越细，且越明亮。通过寡糖带的位置与标准寡糖和盐酸氨基葡萄糖对比就能知道不同寡糖的聚合度；通过寡糖带明亮程度的对比观察可知道同一批次反应体系中哪种条件下得到的壳寡糖最多，哪几种聚合度的寡糖更占优势。由图可知，在分离胶浓度17.5%和浓缩胶浓度3%时，在酶与壳聚糖质量比为4∶100时，得到的壳寡糖最多，且多为聚合度3～7的壳寡糖。
2.2.3 对比图3、4可知，采用连续SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的寡糖带亮度较低且弥散，很难将不同聚合度的壳寡糖分开，而采用不连续SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的寡糖带细且亮，很容易分出不同聚合度的壳寡糖。
2.3 小结
在浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为17.5%，上样量为10 μl，恒定电流为45 mA，电泳时间50min条件下进行SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳时，能获得最佳的壳寡糖分析图谱。
3 讨 论
3.1 在样品液标记过程中温度与时间是引起糖苷键断裂的主要因素，时间过长或温度过高都会使大分子寡糖被降解生成很多氨基葡萄糖或小分子量的寡糖，但从作者的电泳图上可看出氨基葡萄糖和小分子量的寡糖很少，说明样品液的标记条件较好。
3.2 本实验样品缓冲溶液的成分是Tris?盐酸缓冲溶液、5%SDS、甘油、溴酚蓝，相比不连续电泳的样品缓冲溶液［7］少了巯基乙醇和降低了SDS的量,这是因为巯基乙醇的作用是使分子中的二硫键断裂，而糖分子中并不存在二硫键，所以不用加巯基乙醇。SDS的作用是使糖带上大量的负电荷，这样糖分子量的大小就直接决定了糖在电场中的泳动速率。但SDS本身就是一种盐，而我们制得的寡糖自身就带有不少的盐，如果SDS的浓度过高就会导致糖从溶液中析出，从而影响结果的观察与分析。
3.3 凝胶浓度主要由糖分子量的大小来决定，本实验制得的寡糖样品可采用10%～20%的凝胶。采用12.5%与15%的分离胶与3%的浓缩胶进行不连续SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果如图1、2,显示出不同聚合度的寡糖与盐酸氨基葡萄糖条带，但是条带比较粗不清晰，分辨率不高。改进为采用17.5%的分离胶与3%的浓缩胶进行电泳，就能看出单一清晰的细条带，且分辨率高。
3.4 上样量的多少会影响条带的深浅。随着上样量的增加，条带的明亮度会越来越高，但上样量过多会导致各条带都很明亮而判断不出主要的降解产物且会导致严重的拖尾现象，而上样量过少会使条带灰暗而观察不出样品液的浓度梯度变化。通过多次实验筛选出上样量为10μl，在电泳图上可观察到明显的梯度变化，且有单一清晰的条带。
【文献】
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