江浙蝮蛇毒诱导类风湿性关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究

                        作者：胡珏 杨旭燕 吕庆华 许东航

【关键词】  江浙 蝮蛇毒 类风湿性关节炎 滑膜细胞凋亡

 类风湿性关节炎（RA）是一种以滑膜增生、淋巴巨噬细胞浸润滑膜层并伴有少量的凋亡为特征的自身免疫性疾病。既往研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2在RA患者中较普通骨关节炎患者显著上调，从而抑制滑液成纤维细胞的凋亡，并导致RA患者滑膜的超常增生［１，２］。 江浙蝮蛇毒（Agkistrodom halys Pallas venom，ASV）的主要活性成分蛇毒蛋白有诱导凋亡和抗肿瘤作用，临床上已被用于类风湿性关节炎等慢性疾病所致的炎症和疼痛［３，４］。然而，ASV对RA患者的治疗作用机制尚未明确。作者自2007年2至7月检测ASV对RA患者滑液成纤维细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用。

    1  临床资料

    1.1  一般资料  选择浙江大学附属第二骨科行膝关节置换术的RA患者6例，其中男3例，女3例；年龄34～62岁，平均（50±10）岁；病程6～30年，平均（14±10）年。所有患者皆符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的RA诊断标准。

    1.2  主要试剂  DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶、FBS，美国Gibco公司；ASV由浙江龙图蛇业集团有限公司提供，-20℃ 保存；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit，美国BD公司；鼠抗人bcl-2-FITC-mAb、羊-抗鼠-FITC-IgG-mAb，美国Caltag公司；碘化吡啶，美国Sigma公司。

    1.3  滑膜细胞的分离和培养  无菌条件下，从关节置换术获得的滑膜组织切成3～5 mm的碎片，用胶原酶Ⅱ和等体积的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2孵箱中消化4 h。常规离心，弃上清液后加0.25 %胰酶1 ml，混匀后消化30 min。1000 r/min离心后弃上清液，加入含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，放至37 ℃、5 %CO2孵箱中孵育，常规传代培养。

    1.4  MTT法检测ASV对RA滑膜细胞活力影响  调整细胞悬液浓度为7×104/ml左右，接种于96 孔培养板中，每孔体积100 μl，培养24 h。加入不同质量浓度的ASV（1.25、2.5、5、10 μg/ml），以溶剂为阴性对照，再入培养箱于相同条件下培养。分别培养24、48、72 h后，每孔加入10 μl MTT（5 mg/ml），在培养箱内放置3 h，试验结束时吸去上清液，加入150μl DMSO，震荡10 min，用酶联免疫检测仪于490 nm处测定各孔吸光度（A）值，记录结果，抑制率。

    1.5  细胞凋亡检测  采用流式细胞仪结合碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC双标记染色测定细胞凋亡率。取对数生长期细胞，细胞浓度为2×105/ml。分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10μg/ml），作用24、48 h后，胰酶消化收集细胞。PBS洗涤细胞2次，用1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC，混匀，室温避光孵育15 min，再加入5 μl的20 μg/ml的PI，混匀后室温避光孵育5 min，在1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

    1.6  细胞周期分析  取对数生长期的细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10 μg/ml），作用24 h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，70 %冰乙醇固定，4 ℃保存。上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗涤2次。加入500 μl PI （50 μg/ml），4 ℃避光染色30 min，用200 目尼龙网过滤，上机检测。

    1.7  Bcl-2蛋白表达分析  取对数生长期的细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10 μg/ml），作用24 h后，用含70%乙醇的PBS 1ml渗透细胞30 min，冲洗2 次，弃上清液。加FITC标记的bcl-2单抗（1∶50）100μl，4 ℃下孵育30 min，PBS洗2次。加FITC标记的羊抗鼠IgG（1∶200）100 μl，4 ℃下孵育30 min ，PBS洗2次。用PBS代替单抗作阴性对照，立即进行流式细胞仪检测，bcl-2蛋白表达水平以阳性细胞百分率表示。

    1.8  统计学分析  全部实验结果均来自至少3组平行实验，数据用(x±s)表示。组间差异性比较采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，P<0.05有显著性差异。

    2  结果

    2.1  ASV对细胞增殖的影响  MTT比色结果显示，不同浓度的ASV对体外生长的成纤维样滑膜细胞有增殖抑制作用。经1.25 μg/ml ASV处理的细胞生长受到轻微抑制，在ASV2.5～10 μg/ml范围内，抑制作用呈时间和剂量依赖性，与对照组比较，细胞抑制率差异有统计学意义（P<0.05）。据此，选择2.5、5、10 μg/ml作为以下实验ASV的作用浓度。见图1。

    图1  ASV对细胞增殖的影响

    2.2  流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡率  流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡结果表明滑膜细胞加药处理后凋亡细胞百分率明显高于未加药组（P<0.05）。当ASV浓度为5 μg/ml和10 μg/ml时，24 h后与对照组相比凋亡百分率出现显著增加。并随时间的延长及药物浓度的增高，凋亡细胞数增加。见表1。 表1  不同浓度ASV对RA滑膜细胞凋亡率的影响（%）注：与正常对照组比较?P<0.05，**P<0.01

    2.3  流式细胞仪检测细胞周期的变化  不同浓度的ASV对RA滑膜细胞作用48 h，其细胞周期的分析结果见表2。实验结果表明G0/G1期的细胞百分比逐渐增加，S期细胞百分比无明显变化，G2/M期比例明显减少（P<0.05或0.01）。说明ASV的作用在G1～S期，并能阻滞G1期细胞向S期移行，造成G1期细胞堆积，阻滞DNA合成和复制，抑制滑膜细胞周期进程。表2  不同浓度ASV作用HFLS-RA 24 h对细胞周期的影响（%） 注：各实验组与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01

    2.4  流式细胞仪检测bcl-2蛋白的表达  离心收集经不同浓度ASV处理的RA滑膜细胞，以FITC标记的bcl-2单抗与细胞共同孵育后经流式细胞仪分析，结果显示，与对照组比较，2.5 μg/ml ASV组的bcl-2蛋白表达差异不明显，5     μg/ml，10 μg/ml ASV组随药物浓度的增加而bcl-2蛋白表达下降（P<0.05或0.01）。见表3。表3  不同浓度ASV作用HFLS-RA对Bcl-2蛋白的表达 注：各实验组与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01

    3  讨论

    类风湿性关节炎(rheumatiod arthritis，RA)成纤维样滑膜细胞(HFLS)是关节滑膜细胞中主要的一种,可释放多种细胞因子，并可因环境变化发生演变，存在异常凋亡与增殖。RA-HFLS凋亡不足与RA的发病有关［５］。因此，促进引起自身免疫反应的细胞凋亡，就有可能成为此类疾病的一个新途径。

    　　资料表明，蛇毒含神经毒、细胞毒、眼镜蛇毒因子、抗凝血因子、胆碱酯酶等多种活性成分，并富含锌、镁等微量元素，药理作用非常广泛，有明显的免疫调节功能，对RA患者有很好的治疗效果，治疗后患者类风湿因子等有关实验室指标转阴率较高，复发率低，预后良好，特别是能明显改变部分晚期RA患者的关节活动功能，而且无明显毒副作用。蛇毒诱导肿瘤细胞凋亡已从形态学及分子生物学方面得到明确证实。动物实验结果表明，眼镜蛇毒素对大鼠佐剂性关节炎模型的踝关节肿胀程度影响不大，但可显著抑制大鼠棉球样肉芽肿形成，提示眼镜蛇毒素抗RA作用可能主要是对关节滑膜增生过程有一定保护或逆转作用［６］。Dong［７］等研究表明江浙蝮蛇毒(ASV)作用于人白血病Jurkat细胞后，可见ASV具有强烈的细胞毒作用［48hIC50值为（9.78±0.38）μg/ml］，并能诱导细胞凋亡。然而对于ASV引起HFLS凋亡的机制，目前国内外均未见文献报道。

    　　本研究采用MTT法观察ASV对RA患者体外培养的成纤维样滑膜细胞增殖的影响，发现ASV能抑制其增殖，且呈剂量和时间依赖性。在此基础上，作者应用流式细胞仪检测细胞周期变化结果显示，ASV能阻滞G1期细胞向S期移行，导致G1期细胞堆积，阻滞DNA合成和复制，提示可能与抑制细胞周期蛋白磷酸化的G1/S关卡有关。以上研究表明，ASV呈时间和剂量依赖性地抑制滑膜细胞增殖的作用。这与许多研究表明的蛇毒可抑制肿瘤细胞等增殖的结果大致相同［８，９］。

    　　在RA滑膜细胞凋亡相关的分子中，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中一对凋亡相关基因，在细胞凋亡调控中起重要作用，Bax可促进细胞凋亡，而Bcl-2作为原癌基因阻止细胞凋亡。研究证实，RA患者滑膜淋巴细胞T细胞大量bcl-2表达且无凋亡现象，提示bcl-2表达提供给炎症细胞生存信号。Bcl-2过量表达可能抑制RA滑膜细胞凋亡，是RA滑膜增生的原因之一。RA患者滑膜细胞上bcl-2表达上调，可活化凋亡抑制信号，从而促进滑膜细胞的增生和增殖［１０］。对滑膜细胞凋亡机制的研究，为RA多靶点治疗提供了可能。本研究中，ASV诱导滑膜细胞凋亡时伴有bcl-2蛋白表达下降。在5、10 μg/ml浓度范围内，bcl-2蛋白的表达随着ASV浓度的增加而降低。这说明bcl-2在ASV体外诱导RA患者滑膜成纤维细胞凋亡实验中有重要作用，但其如何调控基因表达，还需进一步实验验证。

【文献】
  1 Ceponis A，Hietanen J，Tamulaitiene M，et al. A comparative quantitative morphometric study of cell apoptosis in synovial membranes in psoriatic， reactive and rheumatoid arthritis. Rheumatology，1999，38：431～440.

2 Perlman H，Georganas C，Pagliari L J，et al. Bcl-2 expression in synovial fibroblasts is essential for maintaining mitochondrial homeostasis and cell viability . Immunol，2000，164 (10)：5227～5235.

3 董庆华，郑 树，吕庆华，等. 浙江蝮蛇毒诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的体外实验研究 .中西医结合杂志，2002，22 (11)：936～938.

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6 张黎明，陈志龙，赵杰，等.眼镜蛇毒素抗类风湿性关节炎实验研究.药学实践杂志，2000，18(4)：209～211.

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9 成友军，孔天瀚，董伟华. 中华眼镜蛇毒组分CⅡ-3-1对多药耐药K562/A02细胞株作用研究. 蛇志，2006，18(3)：173～176.

10 Hilbers I，Hansen T，Petrow P K，et al. Express of the apoptosis accelerator Bax in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatol Int，2003，23(2)：75～79.