血小板/T细胞活化抗原1
1985年Burns等以活化T细胞为免疫原制备了抗活化T细胞表面抗原的单克隆抗体，并将其中1株单克隆抗体Leo-A1识别的抗原命名为人T细胞系特异性活化抗原1（T lineage-specific activation antigen1, TLiSA1），实验证实TLiSA1参与了CTL细胞的活化与分化〔1-3〕。随后的实验发现TLiSA1也高表达于血小板表面，并与血小板的活化和凝集功能有关，遂将此抗原重新命名为血小板/T细胞活化抗原1（platelet and T cell activation antigen 1, PTA1）〔4〕。1997年我实验室与澳大利亚Newcastle大学癌症研究中心合作成功克隆了人PTA1 cDNA〔5〕。随后，我室又成功克隆了长臂猿和猴PTA1全长cDNA。PTA1基因的克隆为进一步深入探讨PTA1的功能打下了良好的基础。
有趣的是，PTA1的基因序列与1996年DNAX分子与细胞生物学研究院Shibuya等发表的DNAM-1分子（DNAX accessory molecular-1, DNAM-1）序列相同。DNAM-1分子的发现过程同PTA1十分相似，最初作者制备针对人CTL的单抗，发现其中DX11单抗能明显抑制CTL对多种肿瘤细胞系(如Colo205、PA-1、MCF7等)的杀伤作用。Shibuya等首先从外周血单个核细胞(PBMC)中通过DX11单抗亲和层析纯化了DX11识别的抗原，进行了部分蛋白序列测定，以多肽对应的PCR引物扩增出DNAM-1的部分片段，再以32 P标记的探针进行筛选，最终获得了DNAM-1的cDNA序列。Shibuya认为DNAM-1分子是一种新的粘附分子，并可能与信号转导有关〔6〕。
到目前为止，PTA1的配体（PTA1 ligand, PTA1L）尚未基因克隆成功。本实验室已成功构建、表达了PTA1胞膜外区/IgG1 Fc段融合蛋白，通过PTA1/Ig融合蛋白进行的免疫组化及粘附阻断实验证实PTA1配体表达于肿瘤细胞系Colo205细胞膜表面。PTA1配体的鉴定正在进行之中。
PTA1的基因及结构
1997年Sherrington等从以pCDM8为载体的活化Jurkat细胞cDNA文库中，通过Leo-A1单抗panning的方法筛选得到人PTA1阳性克隆〔5〕。人PTA1基因为单拷贝基因，定位于染色体18q22-q23。其cDNA全长1.4kb，5?和3?端分别有174bp和111bp非编码区。开放读框1 011bp，编码336个氨基酸，包括18个疏水氨基酸的信号肽，成熟蛋白由318个氨基酸组成，属I型跨膜糖蛋白。胞膜外区由232个氨基酸组成，形成2个免疫球蛋白超家族V样结构域，这种结构在免疫球蛋白超家族成员中是唯一的一个。PTA1分子第19和90位的保守半胱氨酸形成链内二硫键，第134和204位的保守半胱氨酸形成第二个链内二硫键，这2个二硫键分别起到稳定胞膜外区2个结构域的作用。在90位和204位半胱氨酸处均存在免疫球蛋白超家族V样结构域的特征性基序Asp-X（Gly或Ala）-X-Try-X-Cys基序。PTA1胞膜外区含有8个潜在的N-糖基化位点和3个潜在的O-糖基化位点。当用内切糖苷酶（Endo F）消化N-连接的糖基后，PTA1的相对分子质量减小了30×103，表明PTA1分子胞膜外区是高度糖基化的，这可能与PTA1参与分子识别有关。PTA1的糖基中含有大量的唾液酸，神经氨酸酶（neuraminidase）消化唾液酸后，其pI由3.5～4.2转变为7.8～8.2。PTA1穿膜区由25个疏水氨基酸组成。胞浆区有61个氨基酸，含有3个酪氨酸、6个丝氨酸和6个苏氨酸，胞浆区尾部含有一段EDIYVNY基序，中央酪氨酸的氨基端有2个带负电荷的谷氨酸和天冬氨酸（ED），羧基端为缬氨酸、天冬酰胺和酪氨酸（VNY），此基序可作为非受体型蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）的底物。并可以和蛋白酪氨酸磷酸酶2（protein tyrosine phosphatase 2, PTP2）氨基端的SH2结构域结合。另外，在PTA1胞浆区还存在着酪蛋 白激酶Ⅱ（casein kinase Ⅱ）和PKC作用的底物S/T结构。胞浆区的上述结构和基序提示PTA1分子可能参与T细胞和血小板活化的信号转导过程〔4，5〕。人、猿、猴PTA1分子cDNA及蛋白水平的同源性为93%～95%，表明PTA1在生物进化过程中高度保守并可能具有重要的功能。
Burns等通过Leo-A1单抗亲和层析的方法从血小板上纯化了PTA1分子，并进行了蛋白部分序列测定，证实PTA1分子为一全新的分子。通过纯化的PTA1分子再次免疫制备了抗PTA1的单克隆抗体NEWE1和NEWI1〔3〕。而后通过免疫沉淀证实从血小板、Jurkat细胞和T细胞上沉淀下来的分子是相同的。采用流式细胞仪检测发现Leo-A1和NEWE1能结合到PMA刺激的Jurkat细胞膜表面，并且平均荧光强度相同，但NEWI1不能在PMA刺激的Jurkat细胞膜表面着色，当增加Jurkat细胞膜通透性后，NEWI1能使Jurkat细胞着色，并且获得与Leo-A1和NEWE1相同的荧光强度，表明NEWI1识别的表位位于PTA1胞浆区。
用Leo-A1单抗进行的血小板裂解物免疫沉淀证实PTA1相对分子质量为(65～70)×103，蛋白带并不均一。O’Farrell双维电泳（two dimensional gel analysis）表明从活化T细胞免疫沉淀得到的PTA1分子为一弥散产物，pI范围为4.0～6.5，而血小板来源的PTA1分子的pI为3.5～4.2，其差别可能是由于糖基化不同造成的，用神经氨酸酶切除唾液酸后，两种来源的PTA1分子pI均转变为8.0，相对分子质量减少为(60～65)×103〔4〕。Burns等还发现，在不同的细胞系及不同的刺激条件下，通过免疫沉淀有2～3种相关蛋白同PTA1分子共沉淀下来，相对分子质量为(65～90)×103不等，pI4.0～6.5。当用Leo-A1单抗及不同血小板活化剂刺激血小板时，PTA1被快速磷酸化，同时相关蛋白中的部分分子也发生了低水平的磷酸化〔4，7〕。但这些共沉淀分子的特性、作用及结构仍不清楚。这些附加蛋白在人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒感染的HUT102B2细胞系中总能被免疫沉淀下来，在PHA刺激的T细胞中有时能沉淀下来，而在Jurkat细胞系中未能沉淀下这种蛋白。这些蛋白的发现总与肌动蛋白（actin）同时存在，提示这些蛋白定位于细胞内。
用125I标记PMA刺激的Jurkat细胞及血小板胞膜，再用磷酸肌醇磷脂酶C（phosphatidyl inositol phospholipase C）处理细胞，然后在Jurkat细胞上清中可以检测到从细胞膜上释放的PTA1抗原，表明PTA1分子至少是部分通过糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol, GPI）方式锚定于细胞膜上的。其它参与细胞信号转导的膜表面分子中，有部分是通过GPI方式锚定于细胞膜表面的。而在血小板上清中未发现PTA1抗原的释放，可能血小板PTA1分子主要以跨膜方式连接于血小板胞膜上，另一种可能是血小板胞膜对外源性酶的作用不敏感。
PTA1的表达及表达调节
已获得的实验证据表明，PTA1主要表达于巨核/血小板谱系、活化T细胞、NK细胞、单核细胞、胸腺细胞、及多种转化的造血细胞系。PTA1较高水平地表达于血小板，平均1 200个分子/每个血小板〔4〕。PTA1在巨核/血小板谱系有组成性表达，并且受到TPA（PKC激活剂）及PHA的上调。在部分白血病细胞系中，PTA1具有异质性表达(如红白血病细胞TF-1、巨核细胞Dami及HEL组成性表达PTA1，而红白血病细胞K562不表达PTA1〔9〕。上述结果提示，PTA1可能与髓样干细胞→CFU-GEMM→巨核细胞→血小板的发育过程及功能有关。另外，某些T细胞杂交瘤、T细胞白血病细胞高表达PTA1，HUT-102B2细胞系表达较高水平的PTA1，长臂猿细胞系MLA-144也高表达PTA1分子〔8〕。
PHA活化的正常T细胞及混合淋巴细胞反应中的活化T细胞表达PTA1分子，并受细胞因子及其它活化剂的调节，其中IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、TNF-α及佛波酯PMA（phorbol ester）均对PTA1表达有上调作用。IL-1和IL-2最佳反应剂 量为200U/ml，PMA的最佳浓度为20～50ng/ml。几乎所有的刺激实验均表明PTA1在刺激后半小时至1小时内引起Leo-A1 McAb结合的减少，随后在10～20小时内PTA1的表达达到高峰。TGF-β对PTA1的表达有下调作用〔3〕。
PMA和IL-2对PTA1表达的上调作用依赖于蛋白质的合成。100μg/ml放线菌酮（cycloheximide）即完全抑制了IL-2和PMA对PTA1表达的诱导。而IL-1的刺激实验有所不同，在实验早期PTA1的表达没有减少，表达的高峰在刺激后7～8小时，15～18小时后降回本底水平，放线菌酮对IL-1的诱导作用几乎无影响，表明IL-1诱导的PTA1快速表达过程不依赖于蛋白质的合成。这一现象，提示可能存在细胞内PTA1分子的储存和PTA1受细胞因子调节的再分布。而且，在血小板中确实存在着膜结合的空泡结构和tortou管道系统，可以作为血小板PTA1分子的胞浆储存池〔4〕。
PHA或CD3 McAb能刺激静止T细胞PTA1抗原的表达。但PHA对Jurkat细胞PTA1的表达无刺激作用，组成性高表达PTA1的HUT102B2细胞在受PHA刺激后，表达水平反而下降。
除MLA-144细胞受PMA刺激后PTA1表达下降外，几乎所有测试细胞受PMA刺激后PTA1的表达均升高。其中，Jurkat细胞对PMA的刺激反应最为敏感和强烈，静止Jurkat细胞不表达PTA1 mRNA，当Jurkat细胞受PMA刺激12小时后开始转录PTA1 mRNA，其转录子1.6～5.0kb不等。PHA预先刺激的外周血T细胞受PMA刺激后，首先PTA1的表达下降并低于未处理水平，6小时后开始渐渐升高，24～30小时后达到高峰（PTA1表达几乎增高5倍），但这种上调作用出乎意料地被A23187完全阻断。单独的PHA、CD3 McAb和A23187均无刺激PTA1表达的作用，当上述试剂分别同PMA同时作用时，均明显减弱或完全阻断了PMA对PTA1表达的诱导作用。
PTA1的功能
1.刺激血小板活化及聚集
PTA1 McAb属于血小板刺激型抗体，这类抗体与巨核细胞发育及免疫性血小板减少有密切的联系，如CD41/CD61(gpⅡb/Ⅲa)、CD9、CD36抗体。PTA1 McAb可以诱导血小板活化、聚集，这种作用需要抗体Fc段的介导，Leo-A1 McAb去除Fc段后即失去了刺激血小板聚集的功能〔4，7〕。有意义的是PTA1 McAb对格兰茨曼血小板功能不全（Glanzmen’s thrombasthenia）患者血小板无活化及促聚集作用，提示PTA1可能与血小板功能异常性疾病的发病机理有关〔4〕。NEWE1在5μg/ml以上浓度均能直接刺激血小板分泌和凝集，NEWE1刺激血小板凝集的潜伏期明显延长，并且这一潜伏期依赖于抗体的浓度。
2.在混合淋巴细胞反应中抑制CTL的分化
将Leo-A1 McAb或其F(ab’)2片段加入MLC或T细胞培养体系中能抑制T细胞向细胞毒T细胞分化，明显减少CTL及LAK细胞产率，这一作用不依赖抗体的Fc段。PTA1 McAb只能在MLC初期发挥作用，抑制CTL的分化，在杀伤阶段Leo-A1 McAb不能抑制CTL的细胞毒活性，提示PTA1作用于CTL的分化阶段〔1-3〕。但DX11 McAb能在杀伤相抑制CTL对多种肿瘤细胞的杀伤〔6〕，提示Leo-A1及DX11 McAb识别的PTA1表位可能不同。
Leo-A1及NEWE1 McAb能以剂量依赖方式抑制CD3诱导的T细胞增殖，它们单独或联合均不能刺激PBMC和纯化的T细胞的增殖。在MLC反应体系中加入10μg/ml抗体，第7天时实验组3H-TdR的掺入率要比对照组低50%左右。
但Leo-A1及NEWE1 McAb对PHA诱导的单个核细胞增殖无抑制作用，对亚适剂量的PHA (1μg/ml)和绵羊红细胞刺激的纯化T细胞的增殖也无抑制作用，这2种抗体对CD2（T111和T112 刺激）诱导的T细胞增殖反应亦无抑制作用，提示PTA1与CD2活化通路是不相同的。
3.PTA1可能参与信号转导
PTA1与Tactile、neuroglian及CEA家族的粘附分子有一定的同源性，PTA1的表达特点及上述同源性提示PTA1可能是某种细胞外分子的细胞膜受体〔7〕。PTA1胞浆区具有PTK、酪蛋白激酶Ⅱ、PKC等多种蛋白激酶的底物结构，其胞浆区的EDIYVNY基序可以作为非受体型蛋白酪氨酸激酶的底物，在其氨基端有2个带负电荷的氨基酸残基，这2个残基与其羧基端的3个残基构成了SH2分子的识别位点，提示PTA1可能参与细胞的信号转导〔5〕。血小板颗粒的释放被认为与蛋白激酶C（PKC）的活化有关，Leo-A1 McAb能持续性诱导血小板聚集，且这一过程不依赖于血小板颗粒的释放。
当Leo-A1 McAb结合PTA1分子后引起了该分子的酪氨酸磷酸化，抑制蛋白磷酸化的激酶抑制剂能抑制血小板的聚集，酪氨酸磷酸化被公认为是信号转导中的主要生化事件〔7〕。由于PTA1分子的胞浆区不含任何激酶活性及可能的结构域，因此PTA1可能通过此SH2识别位点与胞浆内的其它信号转导分子发生相互作用。
4.PTA1与疾病的关系
已获得的实验证据显示，PTA1与免疫相关性疾病有着密切的关系，这些疾病主要包括自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、肿瘤及移植排斥反应。PTA1在移植物抗宿主病、肾综合征出血热、尖锐湿疣患者PBMC，及胃癌浸润淋巴细胞、桥本氏甲状腺炎浸润T细胞中有较高水平的表达。由于PTA1分子表达于活化T细胞，因此PTA1可能参与了这些疾病的免疫应答或免疫病理过程〔9，10〕。
Tabata等发现，类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮患者的外周血及关节液T细胞PTA1的表达水平明显增高。在上述患者中存在着全身或局部T细胞的活化，这可能与上述疾病的发病机理有关〔11〕。在肌炎患者中，PTA1表达水平比正常对照增高，并且PTA1的表达水平与疾病的活动性相关〔12〕。在出血热患者中，CD25及PTA1的表达均升高，在急性期明显高于康复期，提示出血热患者处于较高水平的细胞免疫状态，这有利于机体清除病原体〔13〕。在心脏及肾脏等器官移植患者中，PTA1以及其它的T细胞活化标记（如IL-2R）均高于正常对照，但在心脏移植患者中，PTA1的表达水平与病情未见明显的联系〔14〕。
PTA1分子是具有重要功能的新分子，有关PTA1的进一步研究尚有大量的工作要做。PTA1及PTA1L的组织细胞分布、功能、PTA1/PTA1L的相互作用及其介导的信号转导过程、PTA1与疾病的关系及PTA1L基因克隆是本课题今后进一步研究的主要内容。
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