当前位置：首页 > 论文 > 医药学 > 医学

凋亡调节因子与药物耐受性

来源：岁月联盟作者：佚名时间：2010-07-12

　　肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是临床化疗失败的重要原因。本文综述细胞凋亡调节因子p53、bcl-2、bax等对肿瘤细胞耐药机制的影响和p53蛋白等对P一糖蛋白和多药耐药相关蛋白表达的调节作用，并介绍部分多耐药性新的研究进展。

　　放疗和化疗对肿瘤细胞有明显杀伤作用。然而成功的一个重要障碍是肿瘤细胞对上述治疗无反应，并出现耐受细胞群，导致恶性肿瘤复发或浸润进展。因此了解细胞对化疗药物耐受基础成为许多实验研究的热点。一般而言，研究的重点是解释治疗因子怎样达到细胞内靶位点，并检查药物与靶位点相互作用的分子基础，如高水平表达MDRI基因能够限制多种药物在细胞内的浓度，并引起多耐药性（MDR）。

　　最近几年里，探索和了解细胞凋亡机制，对肿瘤细胞获得或失去耐受细胞毒性机制有了新的认识。

　　1 凋亡调节因子对耐药性的调节作用

　　许多药物能诱导细胞凋亡，包括抗代谢药、脱氧核苷酸合成抑制剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、烷化剂及干扰微管药物等[1]。化疗药物引起凋亡的过程还不十分清楚，可能是药物打断了正常的细胞生长周期所致[2]。凋亡是一种可以被激活或抑制的可调节过程，因此可能还有在某些情况下药物耐受性的新解释。

　　1.1 p53

　　野生型p53（wt-p53）在细胞生长过程中以“分子警察”身份监视细胞内DNA状态，当DNA受损后，p53通过转录后稳定机制抑制细胞停留在G1期，使细胞有时间修复，若修复失败，wt-p53将角发细胞凋亡。wt-p53缺乏或发生突变，将失去“分子警察”作用，不能诱导受损细胞凋亡，而使受损细胞得以生存。但由于细胞失G1期细胞周期检查点的DNA损伤监视作用，易造成诸如缺失、扩增和易位等染色体畸变。

　　Malcomson[3]采用温控p53表达载体转染鼠胚胎成纤维细胞株，在鬼臼乙叉甙（VP-16）作用下，32℃条件时，wt-p53表达，细胞滞留在G1期，明显表现出对药物介导凋亡的耐受性；而在37℃时，表达突变型p53，细胞在VP-16作用下，无明显生长抑制，继续增殖，并显示出剂量依赖性的细胞凋亡增多。提示wt-p53能介导细胞对VP-16的耐受性。wt-p53介导的耐药性可能与药物作用特点有关。VP-16为细胞周期特异性药，主要作用于细胞周期的S期，干扰DNA的合成。一定剂量的VP-16作用细胞后，wt-p53使得细胞滞留在G1期而不继续增殖，因此，VP-16作用的靶位点减少，如同TopoⅡ酶含量下降介导的耐药性一样，引起细胞对VP-16的耐药性。Wosikowski[4]检测13例对阿霉素（ADM）、长春花碱、顺铂（CDDP）、VP-16和胺苯丫啶等耐药的乳腺癌细胞株，仅1例发生p53基因突变。

　　但许多学者认为低浓度化疗药物可引起表达wt-p53的细胞凋亡，在缺乏wt-妇生基因突变后，须大剂量药物方能引起细胞死亡[5]、wt-p53的缺失或突变间接导致了药物耐受性。Lowe[6]通过体内实验发现，表达Wt-p53基因的肿瘤细胞在经γ放射性和ADM治疗后，绝大多数细胞发生凋亡；相反，相同因子治疗p53基因缺陷的肿瘤细胞MEFS，对放疗和几种化疗药物有较强的耐药性。但将wt-p53基因转染到MEFS细胞，低剂量放疗，或小剂量的ADM、VP-16等药物处理后细胞迅速凋亡。另有报道wt-p53能促进体外培养的人粘液表皮样癌细胞凋亡。

　　p53对细胞耐药性的调节可能是双向的，具体作用方式可能与细胞种类、状态及药物作用特点和剂量有关。如突变型p53可能更多引起细胞对细胞周期非特异性药物耐受，而wt-p53介导细胞对某些细胞周期异性药物耐受。

　　1.2 Bcl-2家族

　　一些研究发现bcl-2基因家族蛋白表达水平变化，能显著改变肿瘤细胞株对化疗药物诱导凋亡的阻抗。Dole[7]用bcl-2表达载体转染人类神经母细胞瘤细胞株Shep-1，发现高表达bcl-2克隆的细胞株对CDDP和VP-16引起的细胞毒性呈剂量依赖性阻抗。Miyashita[1]采用基因转染方法，发现bcl-2能使细胞增加对地塞米松、氨甲喋呤、阿糖胞苷、长春新碱（VCR）、VP-16和CDDP等药物耐受性。与对照组细胞相比， bcl-2蛋白并不影响药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但在维持细胞存活中起着重要调节作用。在VP-16和CDDP等化疗药物去除后，bcl-2蛋白能够重新启动细胞增殖，使细胞获得耐药性。

　　Pantazis[8]研究VCR诱导人白血病细胞株U-937/WT形成VCR耐药细胞亚株U-937/RV，在U-937/WT细胞中不能检出凋亡抑制蛋白bcl-2和bcl-xl表达，而在U-9377/RV均可检出；但在U-937/RV中亦可检出bax蛋白表达，后者是一种凋亡启动因子，是一种bcl-2蛋白的异源二聚体，可抵销bcl-2的活性作用，而在敏感株中未检出bax蛋白。由此可见bcl-2家族在细胞耐药过程中的作用也是相互调节和相互制约的。

　　1.3 p53与bcl-2家庭间的相互影响

　　细胞凋亡是一个多因子参加的复杂的生理过程，药物影响能诱发p53和bcl-2等蛋白发生一系列变化，参与细胞的耐药性。

　　Miyashi[9]研究发现wt-p53能与bcl-2基因上p53依赖性的负反应元件结合抑制bcl-2的表达。Eliopoulos[10]检测p53和bcl-2蛋白在敏感和耐药的卵巢癌细胞株中表达水平，结果显示耐药株过度表达p53和bcl-2蛋白，且bcl-2作用环节可能在p53之上。许多临床资料亦发现突变型p53和bcl-2蛋白的高表达与不良预后有关。

　　Ju[11]将wt-p53传染wt-p53阴性的HL-60细胞形成转染株SN3，与母代细胞相比，对化疗药物的敏感性明显增加，如对CDDP和胸苷（thymidine）的敏感性分别增加2倍和50倍；而用突变型p53传染的细胞无比现象。用胸苷合成酶抑制剂FdUrd观察与p53相关联基因表达变化，在各种浓度的FdUrd存在下，很大比例的SN3细胞发生凋亡，而不是停留在S期。母代细胞有不确定的bax水平和高水平的bcl-2表达。在SN3细胞bcl-2检测不出，并维持适当基础水平的bax。FdUrd治疗后，wt-p53和bax水平增加，但bax诱导早于p53，且平行出现细胞凋亡的DNA条带。Perego[12]检测p53与顺铂导致耐药性间的关系时，发现在卵巢癌药细胞株中，突变型p53失去激活bax基因转录能力。

　　这些资料说明p53、bax-2和bax等凋亡调节因子在肿瘤细胞的耐药机制中起重要作用，但作用方式是复杂多样的。

　　2 p53对耐药蛋白的调节作用

　　p53具有不同结构区域。wt-p53与DNA共有区结合后，能正向调节一系列下游基因的表达。另外，wt-姢负向调节许多缺乏wt-p53共有区结合位点基因，包括DNA topoⅡα、MDRI、c-fos和其它病毒和细胞的启动子。

　　2.1 p53对多药耐药相关蛋白（MRP）表达的调节

　　转录因子spl是MRP基因启动子的强激动剂，wt-姢与spl结合，消除spl作用，从转录水平调节MRP表达。Wang[13]将带有虫荧光素酶标记报告基因的MRP启动子与wt-p53共同转染p53阴性的人类非小细胞肺癌细胞株H1299和鼠（10）1细胞，结果显示wt-p53能呈剂量依赖性地显著抑制MRP启动子活性，wt-忍气吞声作用位点为-91到+103bp，该处有数个spl结合位点；而突为型p53只有很弱的作用。同时研究还发现wt-p53还能抑制高表达MRP的CEM/VM-1-5细胞的内源性MRP表达。Oshika[14]采用免疫组化技术检测107例非小细胞肺癌标本，MRP和突变型p53表达有明显相关性，双染色技术显示p53和MRP在一些细胞上同时表达，这些病人预后明显罗无MRP和突变型p53患者差。

　　2.2 p53CF p-糖蛋白（P-gp）表达的调节

　　P-gp是有MDR1基因编码的多药耐药蛋白。wt-作用于MDR1下游启动子，从转录水平P-gp的表达。Straussp[15]将wt-p53与由MDR1下游启动子控制的报告分子共同转染BHK和Sacs-2细胞株，发现wt-p53呈剂量依赖性MDR1基因启动子活性。Strauss[16]在另一研究中发现部分p53的突变体能激活MDR2基因下游启动子转录活恪，他将这种p53突变称为“获得功能性突变”。Linn[17]采用双重免疫组化染色，核p53聚集和P-gp表达经常发生在同一肿瘤细胞，且这种情况在浸润进展期的乳腺癌中更易见到。其推测共同表达突变型p53和P-gp属于一系列分子事件，能导致肿瘤浸润、药物耐受，产生不良预后。

　　3 其它凋亡调节因子对耐药蛋白的调节作用

　　Bcl-2与P-gp作用尚不明确，但Eid[20]采用免疫组化分析70例人睾丸肿瘤Bcl-2和P-gp表达，Bcl0-2和P-gp存在明显的相关性（P=0.004）。

　　C-myc癌基因为一种参与细胞分化和恶性增殖的核蛋白型癌基因，具有促使DNA复制的功能，可在一些致癌因素作用下（如病毒、放射性和化学诱变剂）发生基因重排和扩增而得以活化。C-myc基因表达既可促进细胞增殖又可促使细胞凋亡，这种相互对立的作用受生长因子等调控。

　　C-myc与P-gp的关系还不清楚，但有报告采用Southern印记杂交分析，发现同一恶性脑胶质瘤细胞发生C-myc基因重排及MDR1基因限制性片段扩增现象，推测C-myc基因活性MDR1基因的变化和脑胶质瘤耐药株的耐药性可能存在较为密切的关系。但另一作者采用免疫组化方法研究67例胃癌标本中p53、C-myc和P-gp的表达，P53的异常表达与P-gp表达呈显著正相关（r-0.63,P＜0.05）,C-myc和P-gp的表达无明显相关。

　　N-myc也编码一个调节转录的核酸化蛋白。N-myc基因的扩增与MRP表达增加有关。Bordow[19]采用Rt-PCR观察25例神经母细胞瘤标本，N-myc基因扩增的标本，MRP基因表达水平亦明显增高（P=0.0016），而MDR1基因表达与N-myc癌基因扩增无明显关系。采用N-myc癌基因抑制剂RA研究神经母细胞瘤细胞株SH-SYSY和BE（2）-C，RA抑制N-myc基因表达后，MRP表达随之下降（P-=0.0017），而MDR1基因表达量却增加（P＜0.05）。Norris[20]分析60例原发性神经母细胞瘤标本，亦发现在N-myc扩增的肿瘤，MRP表达水平明显增（P＜0.001）。

　　Kopnin[2]分析人ras基因对MDR1mRNA和P-gp表达影响。ras基因除能激活外源性MDR1基因启动子外，还能引起内源性MDR1mRNA水平升高，P-gp活性增加并使Rhodamine123外排增多，细胞对秋水仙素和其它一些化疗药物的耐药性亦增加。Chin[22]研究发现人MDR1基因启动子也是ras癌基因的靶位点，虽然其产物对MDR1基因的正向调节是非特异的，但与突变型p53有协同作用，而wt-p53无此作用。

　　4 多药耐药性研究进展

　　最近研究资料发现耐药蛋白的表达与其启动子甲基化状态有关。Nakayama[23]采用定量Rt-PCR检测42例急性白血病标本，发现MDR1基因启动子上CpG位点甲基化状态与MDR1基因表达呈负相关。推测MDR1基因表达的必须条件。Kantharids[24]在T细胞白血病细胞株，采用甲基化敏感和甲基化不敏感的限制酶进行Southern杂交分析，MDR现象与MDR1基因5’端去甲基化明显相关。采用去甲基化因子5’一氮脱氧嘧啶治疗P-gp表达阴性和阳性细胞株消除MDR1mRNA表达，可增加细胞对表柔比星（daunomycin）的耐受性。

　　另外一些研究发现非细胞毒性剂量的一些基因毒性药物，特别是DNA交联因子，优先改变可诱导的基因表达，这些作用主要发生在转录水平并引起暂时时性的DNA损伤。Ihuat[25]发现DNA烷化剂丝裂霉素C能明显MDR1mRNA及P-gp表达，并减少药物外输，对ADM耐受性减少到5到10倍。亚细胞毒性的CDDP也有此功能。在单层和球形培养的人和啮齿动物的结肠癌、乳腺癌、白血病、神经母细胞瘤和肝癌细胞株都观察到此现象。

　　Kimsh[26]研究发现MDR1基因启动子含有热休克应答元件，能与热休克反应元件结合，采用榭皮素（quereetin）抑制热休克应答元件与应答因子间的结合，能逆转MDR1介导的耐药性。

　　由于细胞凋亡的相关调节因子介入多药耐药机制，使得肿瘤细胞对化疗药物耐受机制更加错综复杂。因此，在肿瘤细胞耐药性研究中，应从多角度、全方位考虑，才能制定出罗好的治疗方案。另外，对凋亡调节因子介导耐药机制的研究，可通过加强诱导细胞凋亡的途径克服耐药性。为恶性肿瘤的基因治疗提供一些实验依据。

参考文献

　　1 Miyashita T and Reed J Bolld,1993;81:151～157

　　2 Huschtscha L,Bartier WA,Eoss CE,et al.Br J cancer,1996;73:54～60

　　3 Malcomson RDG,Oren M,Wyllie AH,et al.Br J cancer,1995;72:952～957

　　4 Wosikowski K,Regis TJ,Robey RW,et al.Cell Growth differ,1995;6:1395～1403

　　5 Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.Cell,1993;74:957～967

　　6 Lowe SW,Bobis S,McClatchey A,et al.Science,1994;266:807～810

　　7 Dole M,Nunez G,Merchant AK,et al.Cancer Res,1994;54:3253～3259

　　8 Pantazis P,Chatterjee D,Han Z,et al.Eur J haematol,1996;57:79～86

　　9 Miyashita J,Harigal M,Hanada M,et al.Cancer res,1994;54:3131～3135