细胞角蛋白在正常皮肤组织中的表达

             作者：孙 莉，李 红，刘淑梅，徐志秀

【摘要】  目的  观察7种细胞角蛋白（cytokeratins，CK）在正常皮肤组织的表达，并探讨其意义。方法  应用免疫组织化学S-P法对20例不同部位的正常皮肤组织进行CK7（K72.2）、CK8（C-51）、 CK10（DE-K10）、CK14（LL002）、 CK17（E3）、 CK18（DC10）、 CK19（KS19.1）标记，观察不同细胞角蛋白的表达情况。结果  在正常皮肤上皮组织中，7种细胞角蛋白的表达和分布有所不同。结论  有选择地检测一组CK的联合表达，有助于各种皮肤上皮组织的识别。
   
    【关键词】  细胞角蛋白；皮肤；免疫组织化学
    
    
    【Abstract】  Objective  To observe immunohistochemical expression of  seven cytokeratins on skin and to assess its diagnostic value.Methods  Immunohistochemical markers，including CK7（K72.2），CK8（C-51），CK10（DE-K10），CK14（LL002），CK17（E3）， CK18（DC10）and CK19（KS19.1） were used by S-P immunohistochemical staining methods. The expression of cytokeratins was observed.Results  The expressions and distributed patterns of 7 cytokeratins were differentiated on normal skin epithelial tissues of 20 cases.Conclusion  Comprehensive analysis of a selective cytokeratin group， can assist distinguished of various skin epithelial tissues.
   
    【Key words】  cytokeratins；skin；immunohistochemistry
   
    哺乳动物的细胞质含有复杂的细胞骨架蛋白，包括微丝、微管和中间丝。中间丝有细胞角蛋白Ⅰ、细胞角蛋白Ⅱ、结蛋白、波形蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经纤维等6种。上皮细胞胞质中的骨架蛋白除微丝（肌动蛋白）、微管蛋白外，主要是细胞角蛋白（cytokeratins，CK）。CK是上皮细胞的特征性标记物，由生物化学和免疫学方法根据CK分子量的不同，分为20种，是一个庞大复杂的家族。不同类型的上皮细胞和同类型上皮细胞的不同分化阶段，表达不同的CK。当上皮组织发生瘤变甚至癌变后，仍然表达与正常组织基本相同的CK类型。皮肤的上皮性肿瘤，包括表皮和皮肤附属器肿瘤，类型繁多，组织形态复杂，有时鉴别诊断十分困难。研究不同CK在正常皮肤组织的表达，可能对表皮和皮肤附属器肿瘤的诊断具有一定价值。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  材料  所有正常皮肤的研究标本均来自胜利油田中心2003～2004年收检的病例，包括5例乳腺癌根治手术切除标本中远离肿瘤的胸部皮肤，5例直肠癌手术切除标本远离肿瘤的肛旁皮肤和10例不同部位的色素痣切除标本的切缘皮肤。
   
    1.2  试剂  第一抗体为7种不同的细胞角蛋白单克隆抗体，包括CK7（K72.2）、CK8（C-51）、 CK10（DE-K10）、CK14（LL002）、CK17（E3）、CK18（DC10）、CK19（KS19.1），均为工作液；免疫组织化学检测系统采用过氧化物酶标记的即用型UltraSensitiveTM S-P试剂盒；显色试剂为高敏感二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒。以上试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。
   
    1.3  方法  复查胜利油田中心医院2001～2004年收检的所有皮肤上皮性肿瘤病例的存档切片，从中选取所有皮肤附属器肿瘤及部分皮肤癌病例为研究对象。对存档蜡块重新切片，进行免疫组织化学染色。抗原修复，CK7标记皮肤附属器肿瘤采用胰酶消化法，胰酶浓缩液和稀释液1∶3混匀，滴片后37℃孵育15min；CK8、CK10、CK14、CK17、CK18、CK19等6种抗体染色标记的切片，采用柠檬酸缓冲液高温高压法，高压锅内置pH 6.0的0.01mmol/L柠檬酸缓冲液，加热至沸腾，放入切片，密闭高压锅继续加热，喷汽后2min停止。S-P法免疫组化标记，DAB显色。以PBS代替一抗做空白对照。
   
    1.4  结果判定  所有免疫组化染色结果在光镜下进行观察和评判。7种CK阳性表达位置均为细胞质。参照许良中等［1］的方法，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项标准，半定量判断结果。根据显色程度判断阳性强度，分为4级，无着色为阴性，记0分；浅黄色为弱阳性，记1分；棕黄色为中度阳性，记2分；棕褐色为强阳性，记3分。根据阳性细胞数量在观察的同类细胞中所占比例，分为4类，即阳性细胞≤2%为“个别”，记0分；阳性细胞数3%～20%为“少量”，记1分；21%～60%为“中量”，记2分；>60%为“大量”，记3分。综合评价值由两类记分分值的乘积表示，0～3分为（-），4分为（+），6分为（++），9分为（+++）。
   
    1.5  统计学方法  计数资料使用PSMS ３.１医学统计学软件包进行处理，进行χ2检验，数值较小者使用确切概率法检验，P<0.05为有显著性意义的标准。
   
    2  结果
   
    20例正常成人皮肤组织标本中不同CK的表达和分布见表1。不同CK在皮肤组织中的表达强度及阳性细胞数量的综合半定量评价见表2。
   
      表1  7种CK在20例正常皮肤组织中的表达情况（阳性例数/可观察例数）    

    注：与表皮其他成分比较，*P<0.01；与外毛根鞘、皮脂腺细胞比较，**P<0.05；与表皮及汗腺上皮细胞比较，***P<0.05
   
       表2  7种CK在正常皮肤组织中的不同表达（半定量判断）  

    皮肤组织中表达CK的成分有表皮及附属器，附属器包括毛发、皮脂腺、汗腺、大汗腺等结构。我们的观察显示，表皮基底细胞不表达CK10，棘细胞层多数不表达CK8，棘细胞层和颗粒层不表达CK19，这些表达与表皮其他成分比较，差异有显著性；毛囊的内毛根鞘多数不表达CK8，外毛根鞘多数不表达CK10，与内毛根鞘比较，差异有显著性；皮脂腺不表达CK8、CK18，与汗腺比较，差异有显著性；汗腺不表达CK10，与皮脂腺、表皮棘细胞、颗粒层细胞比较，差异有显著性。
   
    3  讨论
   
    作为上皮细胞特征性标记物的CK，根据分子量的不同，分为20种。CK可进一步分为A（acidic）和B（basic）二大亚族或称为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型CK等电点偏酸，相对分子质量较低，基因定位于染色体17q，包括CK9～CK20。Ⅱ型CK等电点偏碱，相对分子质量较高，基因定位于染色体12q，包括CK1～CK8。一种偏酸性的Ⅰ型细胞角蛋白和一种偏碱性的Ⅱ型细胞角蛋白成对地表达于某种上皮细胞。一定种类的上皮细胞和具有向该上皮细胞分化特点的肿瘤细胞中的CK，按一定构成中间丝，其组合方式即该种上皮的CK组型。按CK组型不同可把上皮细胞分为单层上皮、复层扁平上皮和其他上皮（包括移行上皮、间皮、某些腺上皮）三大类。所有CK都由中间的螺旋结构和N-端、C-端组成。中间X螺旋结构由310～350个氨基酸构成，其杆状部分在除CK20外的所有CK中具有很高的同源性。2条单链的CK形成平行的绳状二聚体，2个二聚体形成四聚体，四聚体首尾结合形成原纤维，互相缠绕形成原纤维丝，原纤维丝互相缠绕形成10nm的CK纤维，和其他辅助蛋白一起维护上皮细胞的形态完整性［2，3］。
   
    皮肤包括多种结构，从基底层到角质层CK分子量逐渐增加。表皮的基底细胞胞质中含有分子量46000～58000的角蛋白张力丝，直径约5nm，走向规则，常与表皮表面垂直。棘层细胞胞质中角蛋白较基底细胞丰富，分子量56000～65000。颗粒层细胞含丰富角蛋白束，角蛋白丝分子量63000～67000。角质层细胞胞质中有大量8～10nm直径的角蛋白丝，彼此平行排列，与表皮平面平行。皮肤附属器包括毛发、皮脂腺、汗腺、大汗腺等结构。介绍，毛球的干细胞表达CK15［4］，毛囊的内毛根鞘表达CK1、CK10［5，6］，外毛根鞘表达CK8/18，其内层表达CK6、CK16、CK17［7］，外层表达CK5/8［8］、CK14、CK15［5］；皮脂腺表达CK5、CK14；汗腺也可表达CK5/8、CK5、CK14。我们的实验结果也证实了以上部分观察。另外，我们的实验结果还显示毛球干细胞、内毛根鞘、外毛根鞘表达CK14，内毛根鞘表达CK7，外毛根鞘表达CK19，皮脂腺表达CK7、CK10、CK17、CK19，汗腺表达CK7、CK17、CK18、CK19。表明皮肤附属器细胞的CK表达谱较文献所载更宽，相互间CK表达谱的重叠较多。这种情况是因为皮肤附属器均具有相同的组织起源，均为表皮的衍生物，只是向不同方向分化所造成的。
   
    CK标记在判断结果时，与其他抗体阳性判断的标准有所区别［9，10］，阳性细胞必须在10%以上，有的要求50%以上才能认为阳性。我们应用半定量积分法综合评价免疫标记结果。结果显示CK标记有助于对皮肤不同上皮性结构的鉴别。目前，肿瘤的鉴别诊断中常采用不同CK的联合表达分析。我们观察结果提示，表皮棘层细胞CK10+/CK18+/CK19-，基底细胞CK10-/CK18-/CK19+；表皮鳞状细胞多为CK8+/CK10+/CK18+，而毛发结构多为CK8-/CK10-/CK18-；鳞状细胞CK18+/CK19-，皮脂腺结构CK18-/CK19+；鳞状细胞CK8-/CK19-，汗腺结构CK8+/CK19+；汗腺结构CK18+/CK10-，皮脂腺结构CK18-/CK10+；我们认为，有选择地检测一组CK的联合表达，有助于皮肤不同上皮结构的鉴别，也可能有助于皮肤上皮性肿瘤的诊断和鉴别诊断。当然，确定一组CK联合表达的意义，还需要观察大量皮肤标本的CK表达情况。
   
                           【文献】
   
    1  许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准.癌症杂志，1996，6(4)：229-231.    
    2  Chu PG， Weiss LM. Keratin expression in human tissues and neoplasms. Histopathology， 2002，40(5)：403-439.    
    3  初培国.细胞角蛋白染色在肿瘤诊断中的应用.中华病杂志，2004，33（3）：273-276.    
    4  Liu Y， Lyle S， Yang Z， et al. Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge. J Invest Dermatol，2003，121(5)：963-968.    
    5  Yamamoto O， Hamada T， Doi Y， et al. Immunohistochemical and ultrastructural observations of desmoplastic trichoepithelioma with a special reference to a morphological comparison with normal apocrine acrosyringeum. J Cutan Pathol， 2002，29(1)：15-26.    
    6  Gho CG， Braun JE， Tilli CM，et al. Human follicular stem cells： their presence in plucked hair and follicular cell culture.Br J Dermatol，  2004，150(5)：860-868.    
    7  Misago N， Narisawa Y. Tricholemmal carcinoma in continuity with trichoblastoma within nevus sebaceus.Am J Dermatopathol， 2002，24(2)：149-155.    
    8  Yamamoto O， Doi Y， Hamada T，et al. An immunohistochemical and ultrastructural study of syringocystadenoma papilliferum.Br J Dermatol， 2002，147(5)：936-945.    
    9  Jiang J，Ulbright TM，Younger C，et al.Cytokeratin 7 and cytokeratin 20 in primary urinary bladder carcinoma and matched lymph node metastasis.Arch Pathol Lab Med，2001，125（7）：921-923.    
    10  Amin MB，Tamboli P，Merchant SH，et al.Micropapillary component in lung adenocarcinoma：a distinctive histologic feature with possible prognostic significance.Am J Surg Pathol， 2002， 26（3）：358-364.