儿童风湿病患者肺炎支原体和EB病毒感染的研究

       作者：黄晓华，曹兰芳，赵瑜，马敏，毛海英

【摘要】  目的  探讨肺炎支原体和EB病毒感染与风湿病发病之间的相关性。方法  收集31例儿童风湿病患儿和30例正常对照组，应用酶联免疫吸附技术（ELISA）检测血清肺炎支原体（MP）和EB病毒（EBV）的IgM、IgA抗体。结果  风湿病患儿组MP－IgM阳性16例（51.6％），MP－IgA阳性10例（36.26％），EBV－IgM阳性2例（6.45%），EBV－IgA阳性1例（3.22%）；正常对照组MP－IgM、IgA阳性各2例（6.67％）；EBV－IgM、IgA均阴性。风湿病患儿组肺炎支原体感染明显高于正常对照组（P<0.01和0.05）。结论  肺炎支原体是小儿风湿病患儿感染的常见病原体，可能参与其发病机制。

    【关键词】  肺炎支原体  风湿病  EB病毒抗体  儿童

    Study on the infection of  mycoplasma pneumoniae，EB virus in the children with rheumatic diseases

    【Abstract】  Objective  To explore the relationship between the mycoplasma pneumoniae(MP) infection，EB virus（EBV） and rheumatic diseases.Methods  Specific MP-IgM，MP-IgA and EBV－IgM，EBV-IgA antibody of 31 cases with rheumatic diseases and 30 controls were assayed with ELISA.Results  16 cases (51.6%)were MP-IgM positive，10 cases(36.26%) were MP-IgA positive，2 cases（6.67％）were EBV－IgM positive，and 1 case（3.22％）was EBV－IgA positive in rheumatic diseases group.Either 2 cases (6.67%) were MP-IgM positive，1 case (3.32%)was MP-IgA positive and no case was EBV－IgM，EBV-IgA antibody in controls. That of rheumatic diseases group was higher than that of controls.Conclusion   MP may be the common pathogen in the children with rheumatic diseases and may attend the pathogenic machanism of rheumatic diseases

    【Key words】  mycoplasma pneumoniae   rheumatic disease  EBV-antibody  children

    儿童风湿病是一种全身性的多系统损害的自身免疫性疾病，目前其发病机制尚未十分清楚。感染在儿童风湿病中的作用一直受到人们重视，但有关支原体感染尤其是肺炎支原体和EB病毒(EBV)感染与儿童风湿病的关系国内少见报道。我们采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测风湿病（包括系统性红斑狼疮、幼年型特发性关节炎、皮肌炎、系统性血管炎）患儿活动期血清肺炎支原体和EBV特异性抗体IgM、IgA，并与正常对照组作比较，旨在了解肺炎支原体感染与儿童风湿病的关系，以进一步探讨儿童风湿病的发病机制。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象  2000年8月～2002年9月收集小儿风湿病患儿31例，男10例，女21例，年龄2～14岁，平均年龄（8.0±3.2）岁，其中包括幼年型特发性关节炎(JIA)患儿12例（男5例，女7例）和系统性红斑狼疮(SLE)17例（男4例，女13例），系统性血管炎1例，皮肌炎［1］1例。均于疾病活动期抽取非抗凝静脉血2～3ml，离心后收集血清，置4℃保存；同时收集30例健康儿童作为正常对照组，男16例，女14例，年龄2～14岁，平均年龄（7.2±3.2）岁。

    1.2  研究方法

    1.2.1  MP-IgM的检测  采用Serodia MycoⅡ方法，试剂盒由日本FujiRebio inc生产。

    1.2.2  操作步骤  (1)吸取200μl待测血清，56℃ 30min灭活补体。(2)将灭活后的待测血清25μl，进行倍比稀释1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280。每孔25μl加入U型反应孔内，同时设阳性血清对照。(3)于每份标本的1：10浓度孔中加入25μl非感应粒子作为阴性对照，以下浓度孔中加入25μl感应粒子。最终滴度则为1：20（阴性对照）、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280。轻轻混匀，加盖，于室温（20℃左右）反应3h。

    1.2.3  检测方法  用目测法与阳性血清及非感应粒子对照判断结果。滴度≥1：80者为阳性。

    1.3  MP-IgA的检测  采用ELISA，试剂盒由陕西华煜生物医学技术公司生产。操作步骤：(1)用标本处理液稀释标本（1：100）100μl加入相应孔中。设阳性、阴性、空白对照各一孔，置37℃水浴或湿盒30min；(2)弃去标本液以洗涤液洗涤3次，每次3～5min甩干；(3)加酶标抗体，每孔2滴，空白孔中只加洗涤应用液，置37℃湿盒20min；(4)弃去酶结合物，同上洗板5次，拍干；(5)加显色底物A、B各1滴，置37℃ 5～10min；(6)终止：每孔加50μl终止液终止反应；(7)结果判断：以空白对照孔调零点，酶标仪测450nm下各孔OD值，待测孔OD值/阴性孔OD值≥2.1者为阳性。

    1.4  EBV-IgM、IgA的测定  全病毒EBV-IgM、IgA测定采用ELISA，试剂盒购自德国IBL公司（批号为RE56211），操作步骤按常规进行，判断标准>CUT OFF为阳性。

    2  结果

    检测结果见表1、表2、表3。

    表1  风湿病组与对照组血清MP-IgM、IgA，EBV-IgM、IgA阳性率分析  (%)

     注：与风湿病组比较，*χ2=14.8067，P＜0.01；△χ2=6.3186，P＜0.05

    表2  风湿病组患儿年龄与血清MP-IgM、MP-IgA检测结果分析  (%)

    3  讨论

    支原体是一类缺乏细胞壁的最小的原核细胞型微生物，早在20多年前就有学者提出：支原体特别是发酵支原体是引起人类类风湿性关节炎的可能原因［2］，但未得到证实，尤其是肺炎支原体。1997年Schaeverbeke等［3］用PCR法检测各类关节炎患者的滑膜液标本中的发酵支原体和穿透支原体。从133例各种风湿病患者中取滑膜液标本154份和滑膜活组织检查标本20份发现：38例类风湿关节炎患者中8例（21%）检测出发酵支原体DNA；10例脊椎关节病与外因性关节炎患者中有2例（20%）；5例牛皮癣关节炎中有1例（20％）；31例未分类的关节炎患者中4例（13%）测出发酵支原体DNA；7例反应性关节炎，29例创伤后骨关节炎关节积水，9例痛风关节炎及4例慢性幼年型关节炎均未发现发酵支原体，而任何检查中均未检出穿透支原体，由此提出：发酵支原体感染常伴随原因不明的关节炎症状［4］。也有学者发现：肺炎支原体感染常可出现肺外症状，青年及成人患者15%～45%有肌肉和关节酸痛症状，多为游走性、发作性，以大、中关节为主，关节积液者少见，个别病例自滑液中分离出肺炎支原体DNA［5］。

    本文测定了31例活动期风湿病患儿血清肺炎支原体特异性IgM、IgA抗体，发现MP-IgM阳性率达51.61%（16/31），MP-IgA阳性率32.26%（10/31），明显高于正常对照组（P<0.01～0.05）。风湿病患儿在≤10岁组的MP-IgM阳性率与＞10岁组差异无显著性（P>0.05），而MP-IgA在两组间差异有显著性（P<0.05），在不同种类风湿病患儿中，MP-IgM、IgA的阳性率差异无显著性，提示：肺炎支原体感染与儿童风湿病关系十分密切，但与其风湿病类型无关。

    近年的研究表明微生物超抗原（SAP）是导致风湿病产生的一个重要因素，SAP能特异性激活大量T淋巴细胞，并能迁徙到特定的组织器官，促使细胞增殖，分泌一系列细胞因子，吸引中性粒细胞和淋巴细胞浸润，或直接杀伤靶细胞，产生组织损伤。同时，SAP和B淋巴细胞表面主要组织相容性复合性（MHC）Ⅱ类分子非特异结合，活化B淋巴细胞，被SAP激活的T淋巴细胞反过来可影响结合SAP的B淋巴细胞的活动和增殖，产生多种自身抗体，导致风湿病的产生，尤其是长期应用免疫抑制剂患儿，支原体感染后更易刺激机体产生与风湿病相似的异常免疫反应，包括多克隆T、B淋巴细胞的活化及自身抗体的产生［5］。现已证实：支原体能干扰人体免疫机能和细胞功能，受支原体感染后的细胞在细胞周期、信号转导、凋亡、蛋白质合成、新陈代谢、钙离子通道等诸多方面表现为上调或下调［6］。

    肺炎支原体与人体某些组织存在着部分共同抗原，故感染后可形成相应组织的自身抗体，可导致多系统的免疫损害，其发病机制与直接毒性作用及免疫损害两者有关。同时又因支原体与宿主细胞膜具有相似的抗原成分而能逃避宿主的免疫监视，形成长时期的寄居，在临床上表现为迁延的慢性感染且易反复发作的病程［7］，也可能是风湿病患儿迁延不愈呈慢性过程的一个原因，因而在风湿病患儿因感染出现病情反复、迁延不愈时，应加用大环内酯类抗生素。同时也提示我们：无论风湿病在活动期或稳定期，均应常规检查肺炎支原体。

    综上所述，风湿病患儿的肺炎支原体特异性抗体IgM、IgA的高检出率充分提示：MP感染与风湿病的发作存在显著的内在关系，但MP感染后诱发了风湿病的活动抑或是引起风湿病发病的一个因素及其具体的作用机制尚待进一步深入研究。

    【】

    1  杨锡强.儿童免疫学.北京：人民卫生出版社，2001，558-596.
    2  Schaeverbeke T， Clere M， Lequen L， et al.Genotypic characterization of seven strains of Mycoplasma fermentans isolated from synovial fluids of patients with arthritis.Clin Microbial J，1998，5:1226-1231.
    3  Schaeverbeke T， Renaudin H， Clere M， et al. Systemic detection of Mycoplasma by culture and polymerase chain reaction (PCR) procedure in 209 synovial fluid samples. Br J Rheumatoe，1997，36:310-314.
    4  Sheena J， David S， Felix B， et al.Idenlification of Mycoplasma fermentans in synovial fluid samples from arthritis palients with inflammatory disease.Clin Microbiol J，2000，6:90-93.
    5  曹玉璞，叶元康.支原体与支原体病.北京：人民卫生出版社，2000，156.
    6  潘解萍，陆亚华，马英淳.系统性红斑狼疮患者支原体感染的研究.江苏医药杂志，2002，28(12):897-898.
    7  Haier J， Nasraua M， Franco AR， et al. Detection of mycoplasma infections in blood of pationts with rheumatoid arthritis. Rheumatology，1999，38:504-509.