胃癌组织中SOX4基因的突变分析*

     作者：王志方，葛亚东，聂刘旺

【摘要】  目的  研究胃癌中SOX4基因的碱基及其编码的氨基酸突变情况，探讨其在胃癌发生中的作用。方法  提取胃癌肿瘤及癌旁组织的DNA， PCR扩增胃癌SOX4基因的HMG－box框，并对其进行PCR-SSCP分析，对有差异的样本进行DNA测序。将测序结果用ClustalX软件与正常的HMG－box框序列比对，用DNAStar软件将HMG－box框碱基序列转化成氨基酸序列，再用ClustalX软件与正常的氨基酸序列比对。结果  经序列测定发现在27例胃癌样本中有12例出现点突变，而在癌旁组织中没有发现突变，晚期胃癌的突变率明显高于早期胃癌。结论  SOX4基因突变可能与胃癌的和转移有相关性。本研究为探索SOX4基因突变与人类肿瘤发生之间的关系提供了分子资料。
   
    【关键词】  胃癌；SOX4；HMG－box；突变
   
    The mutation and sequence analysis of SOX4 in gastric carcinoma
        
    【Abstract】  Objective  To investigate the mutation of SOX4 HMG-box in gastric carcinoma tissues and to explore its roles in progression of gastric carcinoma.Methods  The DNA of gastric carcinoma tissues and gastric mucosa tissues were extracted. HMG-BOX of SOX4 gene was amplified by PCR. After PCR-SSCP analyzing ， the different samples were sequenced ，and translated  into peptide ，then analyzed by ClustalX software.Results  12 out of  27 gastric carcinoma samples have mutations，no mutations have been detected in the paracancerous tissues，mutation rate is higher in terminal stomach cancer than in early stomach cancer.Conclusion  This suggests SOX4 gene mutations have some relation with the happening of gastric carcinoma. This study gives some molecular information for further research of the relationship between SOX4 gene mutation and human cancer.
   
    【Key words】  gastric carcinoma；SOX4；HMG-box；mutation
   
    SOX基因是以SRY基因为基本成员的一类新的控制发育的基因家族［1］，在个体发育过程中对性别分化及组织器官形成起重要作用，主要特征为具有一个保守基序HMG-box，可与DNA序列特异结合，是一类重要的转录调控因子［2］。现阶段这方面的研究表明， SOX基因在早期胚胎发育过程中参与多种发育途径，具有重要的作用，参与诸如性别决定、骨组织的发育、血细胞生成过程、神经系统的发育、晶状体的发育等多种早期胚胎发育过程［3］，故人类SOX基因的突变或缺失会导致发育异常和严重的先天性疾病［4～9］。因此，对SOX基因的研究不仅可以揭示性别分化和胚胎发育的机制，而且可为某些疾病的诊断和提供分子方向的资料，有着非常重要的理论和应用价值。
   
    胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在北方，胃癌死亡率占所有恶性肿瘤死亡率的第一位［10］。本文在对胃癌组织DNA的SOX4基因进行PCR－SSCP分析时发现，部分病例发生了点突变，导致氨基酸序列发生变化。提示SOX4基因突变或异常表达与消化道肿瘤的发生、发展具有相关性。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  材料来源  27例新鲜胃癌手术切除标本均取自弋矶山外科手术室，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期9例，Ⅲ期10例，均未经化疗或放射性治疗，每例标本包括原发癌肿和距肿瘤边缘5cm以上的癌旁组织作为对照。经镜检，原发癌肿癌细胞在70%以上，癌旁组织无癌细胞。标本置于细胞冷藏袋中－80℃保存。
   
    1.2  基因组DNA提取  用酚/氯仿法提取基因组DNA［11］。
   
    1.3  主要试剂和仪器  蛋白酶K 、TaqDNA聚合酶（5U/μl）、10×Buffer、MgCl2，dNTP均购于Promega公司。PTC-100 PCR仪(MJ Research company)、电泳仪（北京六一仪器厂）、水平板电泳槽（北京六一仪器厂）、TGL-16高速台式离心机、DU70紫外分光光度计（美国Beckman公司）、TLL－C台式冷冻离心机（军事医学院实验仪器厂）。
   
    1.4  DNA的定量  DNA完全溶解后，吸取5μl DNA溶液，加95μl TE，稀释100倍，在DU70紫外分光光度计上测定OD260及OD280值。1OD260 值相当于50μg/ml的双链DNA，所以DNA浓度为OD260×50μg/ml×100（稀释倍数），纯度依据OD260/OD280 比值，小于1.8，说明有蛋白质污染；大于2.0说明有RNA污染。最佳值在1.8～2.0之间。经测定所提取的DNA均符合要求。
   
    1.5  PCR扩增及产物克隆  引物参照人SOX4基因序列设计，A1：5′-GTG TGG TCG CAG ATC GAG CGG C-3′；A 2：5′-GCC ACT GCC ACC GAC CTT GTC T-3′，上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。该对引物可特异扩增人SOX4基因包括HMG-box在内的约350bp的碱基序列，PCR扩增反应体系25μl，循环参数：95℃预变性5min，94℃ 40s，62℃ 50s，72℃ 1min，30个循环，72℃延伸15min，设阴性对照以检测是否有外源DNA污染，分别取4μl扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶检测，拍照，余下的PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。
   
    2  结果
   
    2.1  PCR扩增结果  27个标本中均有扩增产物。片段大小约为350bp，与正常人SOX4基因扩增一致。PCR扩增结果如图1；SSCP分析结果如图2。
   
      
   
                       图1  PCR扩增结果
   
    M：DNA梯度；N：阴性对照
    1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13为癌组织，14为正常胃组织    
    
          
   
                       图2  SSCP分析结果
   
    1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13为癌组织，14为正常胃组织
    4、5为SOX4基因发生突变的癌组织       
    
    2.2  测序结果  PCR产物经纯化后由上海博亚生物技术有限公司测序，测序结果与正常SOX4序列比对，发现癌旁组织中无突变，而在癌组织中有12例有点突变，根据突变位点差异分为A、B、C、D四种类型，如图3所示。胃癌组织中SOX4基因四种突变类型编码氨基酸序列比较见图4。
   
    3  讨论
   
    SOX基因在哺乳动物进化中（包括人）是高度保守的，而其两侧的碱基变异较大，由此基因编码的一种蛋白质包含一个由70多个氨基酸残基组成的DNA结合区域，即HMG-box，HMG-box区的氨基酸也是高度保守，两侧表现很大的差异。SOX4基因属于SOX基因家族的C组，主要参与心脏管腔发育和B细胞发育。目前研究表明，SOX4基因的异常表达与多种疾病的发生有关，如急性髓细胞白血病、急生乳腺肿瘤、结肠癌、小细胞肺癌等［12］。SOX4基因的HMG结构域长79个氨基酸残基，可以以序列特异的方式与DNA的小沟结合使其产生较大的弯曲，从而调节靶基因的表达，所以相应的HMG盒内的突变(如错义突变)将影响其对下游调控基因的DNA序列的特异识别和结合，进而影响SOX4蛋白正常转录激活功能，导致疾病的发生。
   
    本研究对胃癌组织标本DNA进行PCR扩增并测序发现，在27例标本中共有12例发生突变，且都为癌组织，癌旁组织中没有发现突变。根据突变位点差异，我们将其分成四种类型，A型5例：有7个点突变位点，分别是10451bp处C－A，10669bp处G-A，10682bp处G-C，10688bp处C-G ， 10702bp处 C-A， 10703bp处T-C， 10706bp处C-T；B型3例：有6个突变位点，10669bp处G-T ，10702bp处 C-T， 而10682bp、10688bp、10703bp、10706bp的突变与A型一致；C型3例：4个突变位点，分别是10682bp、10688bp、10703bp、10706bp，突变与A、B一致；D型1例：只有一个突变位点，位于10677bp处，由G-C。在所有突变中，只有A型的10451bp、10669bp和B型的10669bp处的突变在HMG盒内，其余均在HMG盒外。

    
    对氨基酸序列分析发现，A型中10669bp处突变导致精氨酸（R）突变为谷氨酰胺 (Q)，10702bp处突变导致丙氨酸(A)突变为天冬氨酸(D)；B型中10669bp处突变导致精氨酸（R）突变为亮氨酸（L），10702bp处突变导致丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)；D型10677bp处突变导致谷氨酸(E)突变为谷胺酰氨(Q)；其余的均为同义突变，氨基酸没有发生改变。从氨基酸的突变可以看出：精氨酸为碱性氨基酸，带正电荷，当突变为不带电荷的谷氨酰胺，不利于SOX4基因与DNA的结合；丙氨酸为非极性氨基酸，位于疏水核内，对于维持蛋白质三级结构的稳定起重要作用，若突变为极性荷电的氨基酸－天冬氨酸，则破坏疏水作用，导致高级结构的解体，从而失去结合DNA的能力；精氨酸突变为中性氨基酸亮氨酸，同样不利于与DNA的结合；缬氨酸虽然也是中性氨基酸，但其结构要比丙氨酸大得多，因而使得整个肽链结构趋于松散，不利于与DNA的结合。所以可以推测突变导致SOX4基因与DNA的结合能力下降，影响了SOX4蛋白正常转录激活功能，导致其不能对下游调控基因的DNA序列特异识别和结合。推测这些突变可能与胃癌的进展和转移有一定的关系。
   
           
   
            图3  胃癌组织中SOX4基因四种突变类型DNA序列的比较    
    
    27例病例中有12例发生突变，总突变率44.4%，其中Ⅰ期8例仅有2例突变，突变率25%，分别为D型1例和C型1例。Ⅱ期9例有4例突变，突变率44.4%，分别为B型2例和C型2例。Ⅲ期10例有6例突变，突变率60%，分别为A型5例和B型1例。仔细分析可以发现，突变多出现在临床Ⅱ、Ⅲ期，即晚期胃癌的突变率和突变位点明显高于早期胃癌。提示SOX4突变可能与胃癌的进展和转移具有相关性。因此深入研究SOX4基因与胃癌的关系，将有十分重要的意义。
   
          
   
          图4  胃癌组织中SOX4基因四种突变类型编码氨基酸序列比较    
    
                         【】
   
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    12  陈启龙.SOX基因突变和异常表达与疾病发生的研究.医学生物技术应用杂志，2004，7：41-47.