动脉硬化性脑梗死与人类MHC-DRB1*基因多态性的关联研究
【关键词】 MHC-DRB1*；脑梗死；易感基因
MHC-DRB1*gene polymorphism in patients with atherothrombotic cerebral infarction
【Abstract】 Objective To observe the correlativity between MHC-DRB1*gene polymorphism and atherothrombotic cerebral infarction（ABI）.Methods MHC-DRB1*gene polymorphism in 36 patients with ABI and 32 normal control subjects were analyzed by using the polymerase chain reaction/sequence specific primer（PCR/SSP）technique.Results The frequency of MHC-DRB1*0301 allele was significantly higher in patients than that in the controls，RR of ABI patients was 5.46，P＜0.05.Conclusion These findings further verify that immunogenetics play a predominant pathogenetics role in a subset of ABI patients.Individuals carrying MHC-DRB1 *0301 alleles may be susceptibility gene to ABI.This method is more specific，sensitive，simple，rapid and accurate，and could be applied to the routine clinical detection.
【Key words】 MHC-DRB1*; cerebral infarction;susceptibility gene
目前，心脑血管疾病死亡率已跃居各类疾病死亡之首，尤其是在北方寒冷地区，是严重威胁人类健康的常见病，而脑血管病由于其复发率高、致残率高，严重危害着中老年人的生命健康。多项研究结果表明，脑血管病与遗传因素有关，动脉硬化性脑梗死（atherothrombotic cerebral infarction，ABI）是一种多基因遗传性疾病，具有强烈的遗传易感性［1，2］。人类组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是人类最高多态的遗传系统，与疾病的遗传直接相关，其在多基因遗传性疾病中起到重要作用。本文对我国北方汉族ABI患者及健康人，采用先进的聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）技术，从DNA水平上探讨ABI的易感基因，为诊断、及预防提供依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象 ABI组：按照1996年全国脑血管病学术会议修订的诊断标准［3］，并经CT或MRI证实。选择ABI患者36例，其中男21例，女15例，年龄43～65岁，平均（56.1±4.1）岁。除外糖尿病、原发性高血压患者。对照组：门诊体检健康者32例，其中男20例，女12例，年龄40～60岁，平均（52.1±4.1）岁。 所有受检者均为无血缘关系的东北地区汉族人，并排除肝、肾、内分泌等影响脂代谢的疾病。
1.2 方法
1.2.1 基因引物的设计及化学合成 根据已知的人类MHC-Ⅱ类（DR）基因密码顺序，可选择性地合成每一MHC-DRB1*等位基因或亚基因引物及反义引物一对（针对DRB1*第2外显子基因多态性设计SSP），分别特异性地扩增所需检测的DNA片断，每对SSP所扩增的产物具有等位基因的特异性，其只能与某一等位基因特异性片断碱基序列互补性结合。全部引物由美国PEL-Freei生物工程公司提供。
1.2.2 基因组DNA提取 采集所有研究对象的外周血5ml，5％EDTA抗凝，应用Resse介绍的方法提取基因组DNA，被用于50μl PCR扩增反应体系。
1.2.3 PCR-SSP方法 使用美国PE公司生产的PCR仪（9600型）及有关试剂，PCR扩增15μl内含5pmol特异性引物，内参照物0.5pmol，dNTP各50μmol/L，Taq酶0.5u，10×PCR缓冲液1.5μl。预变性94℃ 60s；变性94℃ 60s；退火58℃ 30s；延伸72℃ 45s；后延伸72℃ 300s，共计35个循环。
1.2.4 结果分析 扩增产物经2％琼脂糖常规电泳，15～20min，经全自动凝胶成像仪观察结果并拍照（见图1）。
图1 2例ABI患者的MHC-DRB1*分型图示
1.2.5 统计学方法 组间等位基因频率比较利用χ2检验，相对危险度（relative risk，RR）用以评价关联的强度。
2 结果
2.1 已知MHC-DRB1*基因型DNA PCR-SSP分型结果 标准DNA分别用MHC-DR7、DR9、DR15和DR16基因的特异性引物扩增，均出现了清晰的已知特异性扩增条带（见图2）。本实验PCR-SSP分型结果符合率为100％，表明对所需基因片断的扩增是成功的。
图2 已知MHC-DRB1*特异性DNA扩增带
2.2 PCR-SSP分型结果 图1为2例ABI患者的MHC-DRB1*基因分型结果，表1比较了人类MHC-DRB1*各等位基因在36例ABI患者和32例健康正常人中的分布情况，可见MHC-DRB1*0301等位基因在ABI患者组和正常人组中的分布有明显差异。人类MHC-DRB1*0301基因频率ABI组明显高于正常对照组，ABI中MHC-DRB1*0301（RR=5.46，P＜0.05），这种差异提示人类MHC-DRB1*0301等位基因与ABI有关，可能是我国北方汉族人ABI的易感基因之一。表明带有MHC-DRB1*0301等位基因的人对ABI易感性增强、发病危险性增高。其他MHC-DRB1*各等位基因和亚基因在ABI组和正常人组未见明显差异，无统计学意义。
表1 MHC-DRB1*各等位基因在ABI及正常人中的分布MHC-DRB1*
注：NS表示差异无显著性
3 讨论
动脉硬化性脑梗死（ABI），其临床上具有发病率高、致残率高、致死率高等特点，是目前严重威胁中老年人健康的主要疾病之一。ABI与遗传的关系已日益引起重视［4］，根据多项研究结果表明ABI是多基因遗传性疾病［5］。MHC是迄今已知的人类最复杂、最具有多态性遗传系统，与疾病的免疫遗传直接相关，其在多基因遗传性疾病中起到重要作用，特别是Ⅱ类基因的多态性，为人类的研究提供了极好的遗传背景资料。但迄今为止，其发病机制仍不十分清楚。在众多研究发现中，ABI所具有的遗传素质倾向及免疫失衡已引起众多学者的关注，一致认为免疫机制在ABI的发生中起了至关重要的作用。由于人类免疫遗传基因位于MHC区域内，且其在免疫遗传和免疫调控中的特殊作用，我们从免疫遗传学角度对该病进行了研究，发现ABI与人类的免疫遗传基因（MHC-Ⅱ类）的多态性有关，尤其是与MHC-Ⅱ类基因的DR关系密切。由于既往的研究均采用血清学和细胞学的方法，对Ⅱ类抗原辨别困难，且因同源性干扰，各抗原之间常发生交叉反应，假阳性率高，影响认识的正确性及深度［6］。1992年，瑞典的Olerup 和Zetler Quist首创的顺序特异性引物法（PCR-SSP）是目前MHC各等位基因研究中最先进的方法之一。新近研究表明，人类MHC-DR抗原在DNA序列上还存在着高度多态性。为了分析汉族人MHC-Ⅱ类DR基因在ABI发生发展中的作用机制，为该病的诊断、和预防提供依据，也使基因分型早日代替血清学分型，我们首先采用PCR-SSP技术对我国北方汉族人ABI和健康人的MHC-DR基因进行了检测分析。
研究结果表明，MHC-DRB1*0301等位基因频率在ABI组明显高于正常对照组（RR=5.46，P＜0.05），这种差异表明人类MHC-DRB1*0301基因与ABI的发病有关。可能是我国北方汉族人ABI的易感基因之一。表明携带者有MHC-DRB1*0301基因的人对ABI易感性增强，发病危险性增高。
【】
1 Alberts MJ.Genetic aspects of cerebrovascular disease.Stroke，1991，22:276-279.
2 Yu LH，Uif de F，Debra A，et al.Genetic and environmental influence on blood pressure in elderly twins.Hypertension，1994，24:663-670.
3 中华神经科分会，中华神经外科学分会.各脑血管疾病诊断要点.中华神经科杂志，1996，29：378-380.
4 王新德.脑血管疾病.北京：中国科学技术出版社，1993，121-125.
5 孙宁玲.HLA-DQ1等位基因与原发性高血压的相关研究.中华医学遗传学杂志，1998，5：288-289.
6 张燕征，李龙虎.应用PCR-SSR方法进行HLA-DR快速分型.中国免疫学杂志，1995，11：607-616.
