芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建

关键词：炭疽芽孢杆菌;穿梭载体;重组;基因 

　　摘要:目的 构建携带炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）的两种穿梭载体与上游强启动子。 方法 将解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子克隆到载体pbluescript-sk（+）上，构建载体pBLKSP;以A16R疫苗株（Tox+，Cap-，弱毒株）DNA为模板，设计合成内外侧引物巢式PCR扩增获得保护性抗原（PA）的全基因，先克隆到载体pBLKSP，再将其和质粒PUB110重组构建成两种穿梭载体。 结果 酶切鉴定显示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与报道序列及预计结果一致。 结论 成功构建了带有强启动子的两种穿梭载体。为在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和炭疽芽孢杆菌的分子疫苗研究奠定了基础。
    
　　关键词:炭疽芽孢杆菌;穿梭载体;重组;基因
    
　　Construction of shuttle vector of anthrax toxin protective antigen with upstream strong promoter.
　　　    
　　Abstract:Objective To construct two shuttle vector of anthrax toxin protective antigen with upstream strong promoter. Meth-ods The promoter region of theα-amylase gene of Bacillus amyloliquefacienswas cloned into pbluescript-sk（+）vector;the an-thrax toxin protective antigen whole gene was amplified by nested PCR from A16vaccine strain template.Firstly it was cloned into pBLKSP vector，then recombinated with PUB110vector to form two kinds of shuttle vectors. Results Restriction analysis and DNA sequencing confirmed that the cloned gene fragments encoded anthrax toxin protective antigen. Conclusion Two kinds of shuttle vectors have been successfully constructed.it has set foundation for further study on the highly effective expression in nontoxic an-thracis strain and molecule vaccine research of Bacillus anthracis.
    
　　Key words:Bacillus anthracis;Shuttle vector;Recombination;Gene
       
　　炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的一种兽源性人畜共患的急性传染病，主要通过皮肤接触、呼吸道、消化道等多种方式感染，其死亡率极高。因此，开展炭疽疫苗等预防性研究在我国还是尤为重要。炭疽芽孢杆菌含有两种能够独立复制的质粒pXO2和pXO1，分别编码细菌荚膜和炭疽毒素 ［1］ 。质粒pXO1编码3种毒素:保护性抗原（Protective anti-gen，PA）、致死因子（Lethal factor，LF）和水肿因子（Edema fac-tor，EF） ［2，3］ 。保护性抗原PA介导EF/LF进入细胞内发挥毒性作用但本身并不具有任何毒性，是一种很有效的保护性抗原和免疫原，而且是获FDA批准的人用炭疽疫苗AVA的主要免疫活性成分。本实验克隆和表达炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）全长基因，以能在芽孢杆菌中自主复制并有穿梭功能的载体PUB110为基础，构建了具有强启动子双筛选功能的两种大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭载体pJB1和pJB2，为进一步其在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和能否作为预防炭疽芽孢杆菌感染的分子疫苗打下了基础。
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料
    
　　1.1.1 菌株与质粒 A16R疫苗株（Tox+，Cap-，弱毒株），无毒炭疽疫苗株（pXO1-pXO2-型ΔSterne-1株）由卫生部兰州生物制品研究所惠赠;质粒Pbluescript-sk（+）由上海生工惠赠;穿梭质粒PUB110邮购自美国ATCC细胞库;GM2163（Dam-Dcm-）由NEB北京总代理公司赠送;HB101感受态细胞购于北京经科宏达有限公司。
    
　　1.1.2 酶及主要试剂 TakaRa LA Tag酶，TakaRa T4DNA连接酶，购自北京六合通生物技术有限公司;TOPO  TM TA Cloning Kits购于invitrogen公司;脑心浸液购于北京经科宏达有限公司Kpn I、Xho I、Sma I、BamH I和Pst I购于NEB公司。
    
　　1.2 方法
    
　　1.2.1 PA抗原上游强启动子的构建 根据文献 ［4］ 得到解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶启动子序列:tttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtcc agactgtccgctgtgtaaaaataaggaataaaggggggttgttattattttactgatatgtaaaatat -35 -10 aatttgtataa
    
　　由上海生工进行全基因合成并将合成好的序列按照相应顺序克隆在质粒pbluescript-sk（+）的Sma I和Pst I两个多克隆位点上，经测序序列完全正确，将构建的重组质粒重命名为pBLKSP。
    
　　1.2.2 巢式PCR扩增PA基因 在GENEBANK中找到炭疽毒素质粒pXO1和PA抗原基因的全序列（GI:47566322和GI:10088950），分析PA基因（包括RBS区和信号肽区）在pXO1质粒中对应的位置，然后应用软件Primer Premier5进行内外侧引物的设计，选择最优化的组合。
    
　　外侧引物:sense 5’CGTTGGTTAGCTTGGACAGTTGTATG3’　Anti-sense5’TTTAAACGCATAGGATGTGCCATTG3’内侧引物:sense 5’GGCTCGAGAAAGGAGAACGTATATGAAAAAA CGAAAAGTG3’ Anti-sense5’CCGGTACCTTACCTTATCCTATCTCATAG CCTTTTTTAG3’
    
　　1.2.3 穿梭载体的构建 用Kpn I和Xho I双酶切扩增的PA基因及构建成功的含α-淀粉酶启动子的重组质粒pBLKSP，纯化双酶切的产物，并将纯化后的PA基因及重组质粒pBLKSP按摩尔比1:1加入连接反应体系，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞HB101，涂板于含氨苄青霉素的LB平板上（含X-gal和IPTG），37℃孵育过夜。挑取白色菌落，提取质粒进行PCR鉴定，筛选阳性克隆，将构建的重组质粒重命名为pBLKSPPA。用BamH I单酶切质粒PUB110和构建的重组质粒pBLKSPPA，纯化单酶切产物加入磷酸酶去磷酸化（防止自连），将去磷酸化的PUB110和重组质粒pBLKSPPA在65℃水域灭活后按照摩尔比2:1进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞HB101，涂板于含氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的LB平板上，37℃孵育过夜。挑取白色菌落，提取质粒进行PCR鉴定，筛选阳性克隆，将构建的两种穿梭质粒重命名为pJB1和pJB2（图1）。
　　图1 穿梭质粒pJB1和pJB2的构建（略）
    
　　Fig1 Construction of the Shuttle Vector pJB1and pJB2
    
　　1.2.4 无毒炭疽疫苗株的电转化 电转化无毒炭疽疫苗株 （PXO1-PXO2-型Δsterne-1株），所用基因脉冲转化仪为Bio-Rad公司产品。先将重组质粒在GM2163中去甲基化 ［5］ ，挑取一环无毒炭疽疫苗株接种于5ml BYGY培养液（1.9%脑心浸液，0.5%酵母提取物，0.2%葡萄糖，0.4%甘油，0.1MTris［pH8.0］）中，37℃摇床225rpm振荡培养12h后取1ml转至新鲜BYGY培养液，至OD600在0.85～0.95左右，4℃，5000×g，离心5min后收集其菌体，悬浮于10%的1ml甘油中，加入10μg在质粒DNA混匀后，冰浴3～7h，取0.4ml混合液置于口径为0.2cm的电穿孔杯内，电转化条件为6.25kv/cm，25μF，1000Ω脉冲作用后，在混合液中加入4ml培养基，37℃振荡培养3h，再涂在含抗生素的选择培养基平皿上，37℃倒置培养直至转化子长出。
　　
　　2 结果
    
　　2.1 炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因的PCR扩增 PCR产物电泳结果证实为单一的DNA条带，分子量大小约2500bp，与预期的2369bp结果一致（图2）。
　　图2 炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳（略）
    
　　Fig2 PCR aplification products of Anthrax Toxin Protective Antigen gene
    
　　1:DNA Marker DL15000;2:PA gene;3:Neganive
    
　　2.2 重组质粒双酶切鉴定 根据重组质粒的序列对其用不同的限制性内切酶切割以鉴定重组片段的大小。结果证实重组质粒含有与目的基因大小相同的插入片段（图3）。
　　图3 穿梭质粒pJB1/pJB2双酶切鉴定及PCR验证（略）
    
　　Fig3 Identification of the pJB1/pJB2by digestion with restriction enzyme and PCR aplification
    
　　1:DNA Marker DL15000;2:pJB1/pJB2digested by KpnI;3:pJB1/pJB2digested by SmaI and KpnI;4:PCR aplification using shuttle plasmid pJB1/pJB2
　　2.3 pJB1/pJB2穿梭功能验证 PUB110是一个金黄色葡萄球菌/芽孢杆菌穿梭质粒，要检测融合后的新质粒是否仍具有穿梭功能，需将pJB1/pJB2质粒转化到无毒炭疽疫苗株（pXO1-pXO2-型ΔSterne-1株）中加以验证。电转化后，将平皿中长出的转化子接种在含有10×10 -6 g/ml卡那霉素的培养基中，37℃下静置培养，经5000r/min离心收集菌体，提取无毒炭疽疫苗株总DNA。电泳检查可见，无毒炭疽疫苗株基因组DNA以及pJB1和pJB2质粒DNA带（图4）。
　　图4 从无毒炭疽疫苗株和大肠杆菌中提取的穿梭质粒pJB1/pJB2质粒电泳图谱（略）
    
　　Fig4 Shuttle plasmid pJB1/pJB2extracted from nontoxic Anthrax vaccine strain and E.coli
    
　　1:Chromosome of nontoxic Anthrax vaccine strain;2:pJB1/pJB2ex-tracted from nontoxic Anthrax vaccine strain;3:pJB1/pJB2extracted from E.coli;4:λHind III digest DNA Marker 
    
　　3 讨论
    
　　目前，被批准生产的炭疽疫苗主要有两大类:炭疽减毒活疫苗和PA组分疫苗，但两者都具有局限性。减毒活疫苗会引起严重的全身反应，未能在正常人群中推广应用。美国批准的人用疫苗（AVA，最近重新命名为BioThrax）是一种经氢氧化铝吸附和福马林处理的V770-NP12-R株的培养上清液 ［6］ ，PA是其主要免疫活性成分，但PA在疫苗中不能测定，并且在动物或人群中接种AVA后没有标准化的PA抗体试验 ［7］ 。其次，这种疫苗含有其他可能导致较高局部和全身反应的细胞成分。最后，AVA的接种次数多（5～6次），需要时间长（12～18个月），不宜作为生物袭击的应急接种使用。为使大面积人群在短期内快速产生炭疽免疫力，开发研制炭疽新疫苗已势在必行。
    
　　炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）是一个83kDa介导蛋白，结合到哺乳动物的细胞上，可被宿主细胞furin蛋白酶裂解为PA63和PA20，PA20片段游离后，暴露出EF/LF结合位点，EF和LF高亲和力竞争性结合此位点，经过细胞膜转移到细胞溶质内发挥毒性作用 ［8］ 。保护性抗原（PA）基因全长2369bp，其中2205bp编码由735个氨基酸组成的分泌性蛋白，在紧靠这个区域之前的29个密码子是编码介导分泌蛋白分泌的信号肽区，而保护性抗原（PA）的SD序列则位于起始密码子ATG上游7个碱基的位置 ［9］ ，这个距离和以后PA能否正常表达起着关键作用。本实验克隆和表达炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）全长基因并包括信号肽区和SD序列，为其在自体无毒炭疽疫苗株中实现分泌性表达提供了前提。
    
　　质粒PUB110是一个来自金黄色葡萄球菌的质粒，其DNA序列和芽孢杆菌中质粒的DNA序列有很大同源性，它可以在 金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌之间转移穿梭。目前还没有发现既能在大肠杆菌内复制又能在芽孢杆菌内复制的穿梭型质粒，只有将两种不同的质粒连接起来构建成为双功能质粒才能实现在大肠杆菌/芽孢杆菌中的穿梭能力和高拷贝性。另外，由于两个质粒都不带有炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）的启动子，所以必须重新构建一个启动子。但我们没有采用炭疽芽孢杆菌自身的PA启动子，而是选取的α-淀粉酶启动子构建在PA基因的上游，原因在于α-淀粉酶启动子是一种强启动子，它的功能是PA自身启动子的10～20倍 ［10］ ，所以我们选择了高拷贝的克隆型质粒Pbluescript-sk（+），将解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶启动子构建于它的MCS位点上，然后将保护性抗原（PA）全长基因克隆在其下游，再把构建好的重组体pBKSPPA和质粒PUB110通过一个相同的酶切位点BamH I连接在一起，使其不但具有在大肠杆菌/芽孢杆菌中的穿梭能力而且还具备高拷贝的特点。
    
　　本实验中构建了两种穿梭载体pJB1和pJB2，并通过电转化到无毒炭疽疫苗株（PXO1-PXO2-型Δsterne-1株）验证了其穿梭功能，为下一步在炭疽芽孢杆菌中的表达和能否作为预防炭疽芽孢杆菌感染的分子疫苗打下了基础。
　　:
     
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