脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨

关键词：基质细胞;脐血;集落  

　　摘要:目的 探讨脐血（CB）多系造血集落培养在不同培养条件下脐血造血细胞体外扩增的最佳收获时机。方法 将从新鲜CB标本中分离出的单个核细胞（MNC）分别接种于已建立的无血清培养基，该培养基分别含单用人骨髓基质细胞、单用细胞因子及细胞因子联合入骨髓基质细胞（HBMSC）支持培养体系。在0、6、10及14d各时间点分别取细胞进行巨细胞集落形成单位（CFU-MK）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）及粒单细胞集落形成单位（CFU-GM）培养。 结果 在体外培养过程中，第10d时各组CFU-MK、BFU-E及CFU-GM数均高于组内其它时间点（P<0.05）;在含HBMSC支持培养的组集落生成数优于其它组（P<0.05）。 结论 脐血MNC体外培养过程中，第10d可能是收获的最佳时机。FIBMSC能更好地维持造血干/祖细胞的活性，使其集落形成能数得到有效扩增。 
     
　　关键词:基质细胞;脐血;集落 
     
　　Observation on the optimum time for harvesting hematopoietic cells from cord blood after culture in vitro. 
　　     
　　Abstract:Objective To explore the optimal time for harvesting cord blood hematopoietic cells cultured in vitroby colony multi-plication. Methods Mononuclear cells separated from cord blood were cultured in a serum-free system supplemented with cy-tokines or human bone marrow stromal cells of combination of them.CFU-MK，BFU-E and CFU-Gmwere assessed by semisolid culture assay on d0，d6，d10and d14for determination of progenitor unmber. Results The quantity of CFU-MK，BFU-E and CFU-Gm on d10after culture were significantly higher than that of other culture time（P<0.05）.The number of colony forming units were higher in the groups supported with human bone marrow stromal cells（P<0.05）. Conclusion The optimal time for harvesting the mononuclear cells is on the tenth day after in vitro culture of cord blood hematopoietic cells.Bone marrow stromal cells is capable of maintaining the activity of hematopoietic cells cultured in vitro. 
　　Key words:Stromal cell;Cord blood;Colony 
        
　　脐血中造血干/祖细胞含量少，难以满足大多数成人造血干细胞移植重建造血及免疫功能的需要，限制了其在临床上广泛应用。通过体外培养实现脐血造血细胞的有效扩增便成为解决问题的关键。目前，脐血造血细胞体外扩增的培养体系多包含有不同的细胞因子组合和以骨髓基质细胞为滋养层以及以骨髓基质联合细胞因子等成分支持脐血体外扩增。在前期的研究中证实 ［1］ ，以上三种方式都可以使脐血造血细胞得到有效扩增，其中以第三种效果最好，但是造血细胞在体外培养过程中不可避免地产生过分化的现象，造成造血细胞体内移植能力的减弱。本实验通过观察扩增后造血干/祖细胞在不同时间点各系集落形成能力的变化，寻找脐血体外培养收获细胞的最佳时机。 
     
　　1 材料和方法 
     
　　1.1 人骨髓基质细胞层的建立 无菌条件取出正常成人供者骨髓液约5～6ml，经淋巴细胞分离液（聚蔗糖一泛影葡胺，比重为1.077，购自医学院血液研究所）密度梯度离心制成单个核细胞（MNC）悬液，接种于含15%FBS，100kU/I青霉素，100mg/L链霉素的IMDM培养体系中。细胞接种浓度为2×10 6 /ml，2d后全量换液，以后每周半量换液2次，培养10～14d，基质细胞层融合（约80%）后，经15Gy60Co照射备用。 
     
　　1.2 脐血MNC液体培养体系 无菌采集正常足月妊娠健康产妇的脐血10例，ACDA抗凝，新鲜脐血按4:1体积比加入羟乙基淀粉30～45min去除沉淀的红细胞，经淋巴细胞分离液密度梯度离心分离山MNC悬液备用。无血清培养体系为Stemspan  TM 培养液（Stemcell公司产品）。加入细胞因子SCF、FL及TPO浓度均为40ng/ml（英国Pepro tech公司）。脐血MNC接种浓度为1×10 6 /ml。实验分组如下:A、对照组:无细胞因子及HBMSC;B、培养液中含HBMSC:C、培养液中仅含细胞因子:D、培养液中同时含细胞因子及HBMSC，种入25cm 2 培养瓶于37℃，体积浓度为5%CO 2 的全湿培养箱中培养14d，分别在d6、d10及d14半量换液，计数细胞总数并取出细胞进行半固体集落培养。 
     
　　1.3 脐血造血祖细胞集落培养 对培养前脐血MNC及每次换液细胞进行CFU-MK、CFU-GM及BFU-E集落培养。BFU-E及CFU-GM用半固体MethoCult  TM GF（H4434）（Stemcell公司）培养基，含1%甲基纤维素，30%FBS，i%BSA，10 -4 M2-ME，50ng/ml rhSCF，50ng/ml GM-CSF，10ng/ml rhlL-3，3U/ml rhEPO，细胞接种于24孔培养板，培养14d后倒置显微镜下计数各种集落数，显微镜下以含50个细胞以上的细胞团为一个集落;CFU-MK用MethoCult  TM -C试剂盒（含无血清培养液、胶原及与CD41结合的原位APAAP染色系统）检测，具体操作方法根据试剂盒说明书进行。 
     
　　1.4 统计分析 运用SPSS11，0统计软件包分析，以P<0.05为差异有显著性。 
     
　　2 结果 
     
　　本实验所用半固体培养基MethoCult  TM GF（H4434）可支持CFU-GM及BFU-E等集落生长，接种第1～2d倒置显微镜下观察仍为分散的单个细胞，第3d开始增殖，起初为几个细胞丛，第7d后可见集落，7～14d集落不断增多，14d后集落逐步减少，集落形成单位为含50个以上细胞的细胞团，其中CFU-GU为无色的细胞团，有的呈密集型集落，有的呈疏散型;BFU-E为粉红色集落，集落内细胞完整，细胞间紧密相连。CFU-NK经固定及染色后为呈粉红色胞膜，淡蓝色核的细胞群体，而非巨核系集落或细胞簇则仅核着色，呈淡蓝色。3个以上巨核细胞组成的细胞团称为CFU-MK。各组不同时间点集落形成单位体外扩增数，见表1。 
    
　　表1 A组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数（/10 5 个MNC）（略）
    
　　注: ▲ 各集落形成单位内d0与d6、d10及d14比较时，P<0.05; ● 各集落形成单位内d6与d10及d14比较时，P<0.05; ☆ 各集落形成单位内d10与d14比较时，P<0.05。
     
　　表2 B组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数（/10 5 个MNC）（略）
　　注: ▲ 各集落形成单位内d0与d6、d10及d14比较时，P<0.05; ● 各集落形成单位内d6与d10及d14比较时，P<0.05; ☆ 各集落形成单位内d10与d14比较时，P<0.05。
     
　　表3 C组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数（/10 5 个MNC）（略）
　　注:各集落形成单位内d0与d6、d10及d14比较时，P<0.05; ☆ 各集落形成单位内d10与d14比较时，P<0.05; ■ 各集落形成单位内d0与d10比较时，P<0.05，与d6及d14比较时，P>0.05; ● 各集落形成单位内d6与d10比较时，P<0.05，与d14比较，P>0.05。  
　　表4 D组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数（/10 5 个MNC）（略）
　　注: ▲ 各集落形成单位内d0与d6、d10及d14比较时，P<0.05; ● 各集落形成单位内d6与d10及d14比较时，P<0.05; ▲ 各集落形成单位内d10与d14比较时，P<0.05。
       
　　A组对照组在体外培养过程中，随着时间的延长其各集落形成能力不断下降，到第14d时已无集落生长;B、C及D组在体外培养的前10d中，其各系集落形成单位数不断增加，第10d后开始下降，第10d时各系集落单位数优于其它时间点（P<0.05）。另外，统计分析表明，含HBMSC支持培养的B、D两组在培养后的各时间点其BFU-E、CFU-GM及CFU-MK数均较无HBMSC支持的组好（P<0.05）。
    
　　3 讨论
    
　　脐血体外扩增是解决脐血绝对数量不足的关键，目前研究指出，脐血造血细胞经扩增培养一段时间后，细胞总数和造血祖细胞数量均显著增加，但另一方面，在培养过程中，造血干祖细胞会产生分化，造成造血细胞活性下降及植入能力降低。因此，改进并优化现有的培养体系是目前研究的热点之一。目前研究脐血造血细胞体外扩增的培养体系多包含有不同的细胞因子组合、以骨髓基质细胞为滋养层以及以骨髓基质联合细胞因子等成分。本实验采用以上三种培养体系对脐血造血细胞进行体外扩增，探讨其对各种集落形成单位的扩增能力及收获细胞的最佳时机。
    
　　实验结果表明，在体外培养第10d时，BFU-E、CFU-GM及CFU-MK分别由原来的（87.30±73.3）/10 5 个MNC、（121.00±18.84）/10 5 个MNC、（48.00±3.00）/10 5 个MNC增加到最高（806.90±196.73）/10 5 个MNC、（515.40±189.11）/10 5 个MNC、（457.56±79.32）/10 5 个MNC，各组第10d时各集落形成单位数均优于其它时间点（P<0.05），第10d后集落形成能力减低，表明体外培养脐血造血祖细胞数在第10d达到最高值，体外培养最佳收获时机应在第10d左右，与国内莫文健 ［2］ 等的报道一致。本实验也表明，单用细胞因子组合支持脐血造血细胞体外培养，其扩增倍数不如用人骨髓基质细胞支持的好，这可能与单用细胞因子支持培养容易造成造血干祖细胞分化成熟有关，细胞因子组合联合人基质细胞支持脐血进行体外扩增，能部分抵消由细胞因子启动的长期培养启始细胞的分化，使造血祖细胞在得到大量扩增的同时能保持造血干细胞的活性 ［3］ 。
　　:
     
　　［1］Wang Cai-xia，Mao Ping，Lin Xiu-mei，et al.Ex vivo expansion of cord blood mononuclear cells supported by human bone marrow stromal cells［J］.Chin J Organ Transplant，2005，26（10）:616～618.
    
　　［2］Mo Wen-jian，Mao Ping，He Qiu-shan，et al.Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells from human cord blood in serum-free cul-ture［J］.J Exp Hematol，2004，12（2）:133～177.
    
　　［3］ Annelise Bennaceur-Griscelli，Cristina Tourino，Brigitte Lzac，et al.Murine stromal cells counteracts the loss of long-term culture initiating cell potential induced by cytokines in CD34+ CD38 low/neg human bone marrow cells［J］.Blood，1999，94:529～538.