针刺对抑郁症模型大鼠海马区单胺类神经递质的影响
【关键词】针刺治疗；抑郁症；疾病模型；大鼠；行为学；5-HT；NE
Effects of acupuncture on serotonin and norepinephrine in hippocampus of depressed model rats
【Abstract】Objective To observe how acupuncture affects the mechanism of depression model rats.Methods Using Open-Field method to randomly select 40 adult SD male rats into normal control, model group, drug treatment and acupuncture treatment group, 10 rats per group. Separation, long term unpredictability, medium stimulation techniques were applied to modify rats? behavior. Then using Open-Field method to reflect changes in depressed model rats? behavior between groups treated with acupuncture and control. And the concentration of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus of rat brain were determined by HPLC-ECD. Results Compared with normal control, acupuncture treatment group’s behavior was not different （P＞0.05）on the 7th day after treatment. On the 21th day after treatment, acupuncture treatment group’s behavior was not different （P＞0.05）with drug treatment group, and was more different with model group（P＜0.01）. Compared with normal group on the 21th day of treatment, the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus of acupuncture treatment group was not different （P＞0.05）, whereas was more different with model group （P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion This experiment proved that acupuncture treatment could change the behavior abnormality of depressive model rats. The curative effects is comparable to flouxetine. The changes of the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus are one of the mechanism.
【Key words】acupuncture treatment；depression；disease model；rat；behavior；5 hydroxytryptamine (5-HT);NE
自1984年，针灸开始介入抑郁症的治疗以来，取得了确切的临床疗效，但是对于针刺作用的过程和机制研究尚不深入。为了探讨针刺在抑郁症治疗中的应用，我们观察了针刺对抑郁症模型大鼠海马区内单胺类神经递质的影响，并与氟西汀（选择性5-羟色胺再摄取抑制剂）作对照。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
成年SD大鼠，体重180～220g，雄性，南京中医药大学动物中心提供。首先用Open-Field法作行为学评分，选择得分相近的40只大鼠进行实验分组。将大鼠随机分为正常组、模型组、药物组、针刺组，共4组，每组10只；正常组每笼饲养5只，模型组及针刺组每笼饲养1只（分养）。
1.2 实验方法
1.2.1 复制模型
［1］复制抑郁症模型：模型组、药物组、针刺组大鼠，共接受21天各种不同的应激，包括冰水游泳（4℃，5min）、热应激（45℃，5min）、禁水（24h）、夹尾（1min）、电击足底（电压50mV，每隔15s刺激1次，每次持续10s，共15次）、摇晃（1次/s，5min）、禁食（24h）和昼夜颠倒等刺激，平均每种刺激各4次。正常组，常规饲养，不接受任何应激性刺激。
于实验第1、21天测定各大鼠行为学（水平运动和垂直运动）。
1.2.2 治疗方法（实验第21天，进入治疗阶段）
正常组，继续常规饲养，每笼饲养5只。模型组，继续分养，每笼饲养1只；常规饲料喂养，不予应激性刺激，也不予任何治疗措施。药物组，继续分养，每笼饲养1只；常规饲料喂养，不与应激性刺激，按照1.8mg/kg给予氟西汀，将药物溶解于生理盐水中灌胃。1日1次治疗，连续21天。针刺组，根据《实验针灸学》［2］大鼠穴位定位方法，选择百会、内关、三阴交，并参照人和动物的穴位解剖结构特点，在华兴邦研制的大鼠针灸穴位图谱基础上，在大鼠前正中线上，额顶骨缝交界线前方处定位神庭穴。针刺方法：常规穴位消毒，选用苏州医疗用品厂生产的“华佗”牌32号1.0寸针灸针进行治疗。百会穴向前斜刺，神庭穴向上斜刺，进针深度约为2mm，内关直刺1mm，三阴交直刺5mm，每穴行均匀捻转刺激30s，留针10min。1日1次治疗，连续21天。
分别于实验第28、35、42天测定各鼠行为学的变化。
1.3 行为学测定
Open-Field法［3］测定大鼠行为学。本实验所用敞箱为正方形，长、宽各80cm，高40cm，底面由面积相等，边长16cm的正方形25块组成，白色内面，以动物穿越底面的块数为水平活动（crossing）得分，以直立次数为垂直活动（rearing）得分，每次3min。
1.4 高效液相-电化学（HPLC-EC）技术与单胺类神经递质的检测
1.4.1 试剂
去甲肾上腺素酒石酸盐（NE）、5-羟色胺盐酸盐（5-HT）、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）（以上为SIGMA公司产品），乙二胺－四乙酸二钠（EDTA）（分析纯，汕头金砂化工厂，批号：010304）、辛烷基磺酸钠（东京化成株式会社，批号：A87509A）、无水乙酸钠（分析纯，南京化学试剂厂，批号：971142）、柠檬酸（分析纯，上海荣润化工有限公司，批号：20010630）、二正丁胺（化学纯，常州市光明生物化学研究所，批号：960308）、高氯酸（分析纯，上海桃浦化工厂，批号：0710）、甲醇（一级品，高效液相色谱专用，江苏淮阴塑料制品厂精细化工研究所，批号：980512），实验用水为重蒸馏水。
1.4.2 仪器
高效液相色谱仪由岛津LC-10A系列组成，LC-10AD泵，SIL-10A自动进样器，进针深度35mm,样品注射速度5μl/s，CTO-10AVP柱温箱，温度18℃，压力为160Kgf/cm2。L-ECD-6A电化学检测器，CLASS-LC10 VER 1.63工作站。色谱柱为Lichrospher C18, 4.6mm×250mm，江苏汉邦科技有限公司生产。
1.4.3 流动相的配备［4］
流动相为乙酸钠(100mmol/L)－柠檬酸(85mmol/L)缓冲液，pH 3.7，内含0.4mmol/L二正丁胺，1.09mmol/L辛烷磺酸钠，0.2mmol/L EDTA，及18%甲醇，真空抽滤，超声脱气15min后使用。流速为0.5ml/min。
1.4.4 样品制备及测定
实验第42天（21天）后，断头处死大鼠，快速取大脑组织，并置于冰皿上，按Glowinski法分离下丘脑［5］，称重后加入0℃～4℃高氯酸提取液330μl（含0.01%半胱氨酸和0.5mmol/L EDTA）以及内标溶液（DHBA0.006mg/ml）20μl，冰浴中匀浆，4℃高速离心(10000r/min)，取上清液注入HPLC-EC检测系统测定单胺类神经递质及其主要代谢产物的含量，进样量为20μl。用内标法定量，峰面积含量。共检测出2种单胺类神经递质，其洗脱顺序依次为：(1)去甲肾上腺素(NE)；(2) 5-羟色胺(5-HT)。
1.5 统计学方法
以均数加减标准误(x±s)表示，统计分析用SPSS12．0统计软件处理。
2 结果与分析
2.1 各组大鼠Open-Field法行为学测定结果
Open-Field法是测定抑郁症大鼠行为学的经典方法，分水平运动和垂直运动两个观察面，以观察得分为评分计算单位。各组大鼠的水平运动评分见表1，垂直运动评分见表2。表1 各组大鼠Open-Field法行为测定水平运动评分结果（略） 注：与正常对照组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01表2 各组大鼠Open-Field法行为测定垂直运动评分结果（略） 注：与正常对照组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明：（1）在造模结束时（实验第21天），与正常对照组比较，模型对照组以及各治疗组大鼠的水平和垂直运动明显降低（P＜0.01）；模型对照组与各治疗组大鼠的水平活动和垂直运动差异无显著性。（2）在治疗第7天（实验第28天）后，针刺组大鼠的行为学评分明显升高，与正常对照组已经无明显差异（P＞0.05）；药物治疗组与正常组大鼠行为学评分相比，尚存在明显差异（P＜0.0１），与模型组行为学评分差异无显著性（P＞0.05）。（3）在治疗21天（实验第42天）后，针刺组和药物治疗组行为学评分与正常组大鼠已经差异无显著性（P＞0.05）；与模型对照组比较，水平运动和垂直运动差异有显著性（P＜0.0１）。（4）在治疗21天后，针刺治疗组大鼠与氟西汀药物治疗组大鼠的行为学评分差异无显著性。
2.2 各组大鼠海马区单胺类神经递质的测定结果
应用高效液相电化学方法测定各组大鼠海马区内单胺类神经递质及其代谢产物的含量。我们在实验第42天，处死大鼠去大脑海马组织进行高效液相电化学检测，仅检测到海马区内5-HT和去甲肾上腺素的含量；5-HT的代谢产物5-HIAA和NE的代谢产物MHPG以及DA和它的代谢产物DOPAC，均没有检测到。5-HT和NE的含量见表3。表3 各组大鼠海马区单胺类神经递质的测定结果（略）注：与正常对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明：（1）与正常对照组相比，模型对照组大鼠海马5-HT和NE降低（P＜0.01）。（2）经过21天治疗，与模型对照组相比，药物氟西汀治疗组和针刺治疗组大鼠海马内5-HT和NE含量明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与正常对照组差异无显著性（P＞0.05）。（3）各组大鼠海马区内5-HT和NE的比值，差异无显著性（P＞0.05）。
3 讨论
关于抑郁症的病因和发病机制尚不确切。一般认为，本病的发生除了与心理－社会因素和遗传因素有关外，主要还由于患者脑内单胺类神经递质减少、相应受体的敏感性改变以及递质系统间失衡等因素有关。许多研究报告发现，抑郁症患者存在生物胺水平和(或)生物胺神经通路功能乃至结构的异常，而NE和5-HT被认为与情感障碍的发生关系最为密切；另一方面，NE和(或)5-HT再摄取抑制剂至今仍然是抗抑郁药的主体。其中，氟西汀是第一个选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，也是至今应用最广的抗抑郁药。研究资料表明［6］氟西汀有抑制神经元从突触间隙摄取5-HT、增加间隙中可供实际利用的5-HT，从而改善5-HT能神经元的功能状态而改善情感症状；同时，可以通过5-HT和NE能神经元之间的交互作用，影响和调节NE神经元功能、增加突触间隙NE含量而发挥抗抑郁作用。而另一方面，大脑内不同区域的功能存在差异，其中海马是边缘系统的重要组成部分，和情绪及动机的产生以及和脑的高级神经活动——学习记忆有关。海马还与额叶皮质、皮层下杏仁复合体、纹状核及下丘脑后部等有复杂的纤维联系；也是Papez情绪动机回路的一个重要环节［7］。应用核磁共振技术发现，与正常人相比，正在患抑郁症的患者左、右两个海马区的体积明显减小，直接提示了抑郁症与海马区的关系［8］。
针灸对抑郁症的治疗有确切的疗效。从我们的实验结果来看，针刺治疗可以显著地改善抑郁症模型大鼠的行为学异常，治疗21天时达到正常组大鼠的水平（P＞0.05），与氟西汀治疗相当（P＞0.05），而与模型对照组的水平运动和垂直运动评分存在明显的差异（P＜0.01）。但是从治疗过程来分析，针刺组大鼠的行为学评分首先得到改善，而且在治疗的第1周就已经与正常组大鼠差异无显著性。显现了针刺治疗抑郁症存在某种独特的机制，提示针刺治疗与药物（氟西汀）治疗在机制上可能存在明显的差异，针刺治疗有起效快的特点。本研究还提示，在深入探索针刺治疗抑郁症的神经生物学机制时，可能需要考虑观察的时间窗等因素，尤其是在治疗的早期和超早期。
我们的研究发现抑郁症模型大鼠海马区NE和5-HT含量降低，而通过21天治疗后，针刺组和氟西汀组海马区NE和5-HT的含量都升高，与模型对照组存在明显差异（P＜0.05，P＜0.01），而与正常对照组差异无显著性（P＞0.05），提示了针刺抗抑郁的作用与海马区、尤其是海马区NE和5-HT神经元功能改善有关。但是进一步的研究，还需要考虑海马区5-HT和NE等单胺类神经递质的动态变化，以及递质对应的受体功能和结构改变、受体之间交互作用等变化。
【】
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8 杜占文．解读抑郁症．国外科技动态，2000，10（375）：14-15．
