肺腺癌患者血清生物标志物的筛选研究
【关键词】 肺腺癌；生物标志物；SELDI－TOF－MS；蛋白质组学
The screening study on lung adenocarcinoma serum biomarkers by SELDI-TOF-MS
【Abstract】 Objective To select relative specific biomarkers in serum from lung adenocarcinoma patients using surface-enhanced laser desorption and ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) protein chip technology.Methods Serum samples from 321 lung adenocarcinoma patients， 321 healthy volunteers with matched gender， age and history of smoking were analyzed using WCX2 potein chip to screening potentially biomarkers. Proteomic spectra were generated by mass spectrometry.Results Five highly expressed potential biomarkers were identified with the relative molecular weights of 4055Da， 4211Da， 4959Da， 5329Da and 7762Da. The sensitivity for diagnosing lung adenocarcinoma was 90.41%， 78.08%， 50.68%， 57.53%， 72.60%; and specificity was 97.06%， 93.44%， 71.15%， 76.36%， 94.92%， when the critical point was made 1.5. The sensitivity for diagnosing lung adenocarcinoma was 86.67%， and specificity was 83.33% by applied to this protein fingerprints pattern validation.Conclusion SELDI-TOF-MS protein chip technology is a quick， easy， convenient， and high-throughput analyzing method capable of selecting several relatively specific， potential biomarkers from the serum of lung adenocarcinoma patients and may have attractive clinic value.【Key words】 lung adenocarcinoma; biomarkers; SELDI-TOF-MS; proteomics
肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一，对人类健康的危害日益严重。目前，肺癌早期诊断困难。80%肺癌患者就诊时已属晚期， 失去了手术根治的机会，放疗化疗效果不佳， 5年生存率不到15%；而早期肺癌手术后5年存活率达70%［1］，但肺癌早期确诊率只有约15%，故肺癌总的预后不良，与肺癌缺乏有效的早期诊断手段有关。因此，寻找灵敏度、特异性高的早期诊断方法是目前临床亟待解决的问题之一。
蛋白质组学作为后基因组学时代的重要研究工具，在肿瘤研究中已广泛应用。表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（surface-enhanced laser desorption Ionization time of flight mass spectrometry， SELDI-TOF-MS）是一种新兴的蛋白质组学研究技术。使用这种技术，组分复杂的生物样品(如细胞液或体液)中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上，用激光脉冲辐射使结合在芯片上的蛋白质解析形成荷电离子，这些不同质荷比的离子在真空电场中飞行的时间长短不同，据此绘制出质谱图，可以简便、快速地获得各种蛋白质的分子量、丰度等信息。本研究使用SELDI技术，检测已明确诊断肺腺癌的患者血清样本，绘制蛋白质质谱图，分别与正常人进行比照，筛选出肺腺癌显著高表达的潜在标志物5个，并建立决策树模型对样品进行筛选。寻找肺癌发生的生物标志物，从而为肺癌的早期诊断提供新的依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 样本来源 来自上海长征等收治的肺腺癌患者321例，其中男187例，女134例，平均年龄60.25±11.58岁(29～76岁)。321例肺腺癌患者均手术后病理证实为肺腺癌。所有肺腺癌患者于术前抽取清晨空腹前臂静脉全血5ml。正常人群321例，男167例，女154例，平均年龄60.23±7.53岁(28～76岁)， 均为无疾病证据的医务人员及健康体检者。分别抽取清晨空腹前臂静脉全血5ml。
1.1.2 实验分组 642例样品中，100例（50例患者、50例对照）用于检测后建立决策树模型，随机抽取60例（30例患者、30例对照）用于建模后的筛选研究。
1.2 方法
1.2.1 血清标本制备 上述所有肺腺癌患者和正常志愿者的静脉血标本，于4℃下3000转/min离心10min，取血清，分装后保存于－80℃冰箱。
1.2.2 蛋白质芯片检测 （1）平衡芯片：取50mmol/L pH=3.0的醋酸钠（NaAc）溶液200μl/孔加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。（2）血清样品稀释：取6μl血清样品，加入234μl 50mmol/L pH=3.0的NaAc溶液中，混匀稀释。（3）芯片上样：取稀释后的血清样品200μl/孔加入芯片的加样孔，置芯片于摇床混匀90min。（4）样品洗脱：取50mmol/L pH=3.0的NaAc溶液200μl/孔加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。取300μl/孔的去离子水冲洗芯片。（5）蛋白质获能：取能量吸收剂SPA（含饱和芥子酸溶于50 %乙腈和0.15 %三氟乙酸）1μl/孔加入芯片加样孔，待挥发后再重复加能量吸收分子SPA1次。所有操作均应在4℃条件下进行（插入碎冰中）。(6)芯片检测:将芯片置入Protein Chip Biomarker System Ⅱ质谱仪处理， 以激光强度160， 作用时间90ns，经机形成血清蛋白质质谱图（其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比，见图1）。
1.2.3 数据处理 用Ciphergen Protein Chip软件和BioMarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据进行处理，所有测得的蛋白质图谱进行统一标准化。采用Biomarker Pattern Software建立决策树模型。两组间蛋白峰相对强度值的比较应用t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 肺腺癌患者与正常人群血清中蛋白质波谱峰的比较 肺腺癌患者与正常人血清差异表达蛋白筛选情况，见图2。
2.2 差异表达蛋白质诊断肺腺癌的价值评价 筛选出的五个肺腺癌差异表达蛋白质波峰的相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da、7762Da， 分别以峰值比1.5为界值时， 其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90.41%、78.08%、50.68%、57.53%、72.60％，特异度分别为97.06%、93.44%、71.15%、76.36%、94.92％（见表1）。表1 肺腺癌高表达蛋白质波峰（略）
2.3 选择差异表达蛋白建立决策树模型 肺腺癌的判断模型由Ciphergen公司Biomarker Pattern Software（BPS）完成，通过选择差异蛋白峰建立决策树模型。BPS自动选用4055Da、4211Da、4959Da、5329Da、7762Da（M/Z）建立模型可以显著区分2组患者（见图3略）。图3表示，此决策树具有3层5个叶节点，100例样本在根节点处被7762Da（节点1）标志蛋白划分为两组，峰值≤48.530的51例样本进入节点2，后用4211Da标志蛋白划分，39例判断为对照，12例判断为患者进入节点4，后用4959Da标志蛋白划分，8例判断为对照，4例判断为患者；峰值>48.530的49例样本进入节点3，后用5329Da标志蛋白划分，1例判断为对照，48例判断为患者进入节点5，后用4055Da标志蛋白划分，2例判断为对照，46例判断为患者。
2.4 建模后双盲筛选 随机抽取60例（30例患者、30例对照）血清，用WCX2芯片得到其蛋白质图谱后，进入该决策树模型，该模型判断认为60例中28例为肺腺癌，32例为正常。和病史资料对照后，30例肺腺癌患者中26例被准确判断为肺腺癌，4例被判为正常对照；30例正常对照中25例被准确判断为正常对照，5例被判为肺腺癌。决策判断模型的盲法验证的准确率为85.00%［（26+25）/60］，灵敏度为86.67%（26/30），特异度为83.33%（25/30）。
3 讨论
肺癌早期常无明显临床症状，且缺乏临床可实用的肺癌诊断、监测用标志物，极易延误诊断，因此寻找肺癌相对特异性肿瘤标志物很有必要。作为肺癌诊断的传统方式，胸片及显微镜下找痰中脱落的癌细胞已临床应用了很多年。但国外已有大型随机对照研究［3］发现胸片及痰找脱落细胞并不能足够早地发现肺癌，不能明显地降低因肺癌致死的危险。如果能有快速、简便、易于为患者接受且准确可靠的诊断方式与高排螺旋CT可早期发现肺部小结节的优势相结合必将大大提高肺癌的早期诊断率，使患者获益。新兴的蛋白质组学研究技术为满足这样的临床需求带来了希望的曙光。
表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（surface-enhanced laser desorption Ionization time of flight mass spectrometry， SELDI-TOF-MS）是一种新兴的蛋白质组学研究技术。2002年诺贝尔化学奖获得者田中耕一于1993年提出该技术的基本原理，同年，美国的Bill Hutchens和Tai-Yung Yip提出了改良的表面增强激光解析电离飞行时间质谱 ［4］。基于这一技术，美国的Ciphergen公司开发出了SELDI蛋白质质谱系统（Protein Chip）［5］。使用这种技术，组分复杂的生物样品(如细胞液或体液)中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上，用激光脉冲辐射使结合在芯片上的蛋白质解析形成荷电离子，这些不同质荷比的离子在真空电场中飞行的时间长短不同，据此绘制出质谱图，可以简便、快速地获得各种蛋白质的分子量、丰度等信息。将正常人样本的图谱信息同某种疾病患者相比较，就有望发现新的疾病特异性相关蛋白质［2，6］。SELDI技术的突出优势在于: 可以分析低分子量(<250OODa)蛋白质，低浓度（fmol级）蛋白质信息，并且可以测定疏水蛋白质，特别适于筛选疾病标志物。2001年底以来，国外采用该技术获得了乳腺癌［7，8］、前列腺癌［9］等肿瘤标志蛋白，且灵敏度、特异性较强。
肺腺癌是一种多基因、多步骤的复杂性状的疾病，包含了多个基因突变的分子事件过程，如抑癌基因的功能丧失、癌基因的活化等。因此，用单个或数个因子的检测进行肺腺癌的早期诊断必定不可避免地存在灵敏度和特异性的矛盾。蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质， 提供了一组蛋白质的功能及其模式的信息，能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响结果［10］ 。SELDI质谱技术是一种新的蛋白质组学的方法，能够同时检测标本中大量的蛋白质，为较整体的检测提供了可能。
本研究应用SELDI质谱技术筛选出了5个肿瘤标志蛋白峰，相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da、7762Da，以峰值比1.5为界值时， 其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90.41%、78.08%、50.68%、57.53% 、72.60％，特异度分别为97.06%、93.44%、71.15%、76.36%、94.92％。通过选择差异蛋白峰建立决策树模型，并对部分样品采用此模型进行盲法验证，其准确率为85.00%，灵敏度为86.67%，特异度为83.33%。由于按照年龄、性别、吸烟史设置对照，排除了以上三种因素对结果的影响。凡与芯片直接相关的平衡芯片、稀释样品、芯片上样等操作步骤均使用机械臂完成，显著缩短了检测耗时，大大提高了检测效率，更重要的是避免了手工操作带来的误差可能，减少了系统误差。
筛选出的5个肿瘤标志蛋白，推测其性质有以下几种可能：肿瘤细胞表达的特异性蛋白质分子；肿瘤状态下人体免疫系统产生的特异性蛋白质分子； 肿瘤状态下人体免疫系统产生的非特异性炎性反应蛋白质分子。
对于本研究中筛选出的5个肿瘤标志蛋白在某些正常人血清中也有出现的现象，笔者认为有以下可能的原因：该“正常人”处于癌前病变状态；炎症性疾病会使一些肿瘤标志物表达增加；人体免疫系统处于的非特异性炎症应激状态。
对于本研究中筛选出的5个肿瘤标志蛋白在某些肺腺癌患者血清中没有出现的现象，笔者认为有以下可能的原因：肿瘤组织本身血循环差，其所产生肿瘤标志物不能分泌到外周血中；人体免疫系统未因肿瘤状态激活。
本研究筛选出的5个肿瘤标志蛋白，特别是分子量为4055Da的蛋白质峰，灵敏度达90.41％，特异度达97.06％，优于传统的肿瘤标志物。且应用SELDI蛋白质质谱技术，具有几乎无创伤、简便、快捷等优势。可考虑将这种技术应用于临床普查，特别是对于肺部发现小节结的诊断不明患者，意义更加突出。
笔者正在对上述差异表达蛋白质进行深入研究，有可能为临床肺腺癌患者寻找到更多无创、有效的诊断、随访方法。SELDI蛋白质质谱技术方法简便、快速、标本用量少，是筛选肺癌标志物的有效手段，可能具有较好的临床应用前景。
【】
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