苦参碱对单核细胞源性泡沫细胞形成及PPARγ，caveolin?1表达的影响

【摘要】  目的: 观察苦参碱对ox?LDL诱导的单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇脂和PPAR?γ, 小凹蛋白?1表达的影响. 方法: 用荧光分光光度法测定胆固醇浓度;采用TBARS法检测细胞内脂质过氧化产物；用油红O染色法检测泡沫细胞的形成；用荧光RT?PCR和Western Blot检测PPARγ, caveolin?1的表达. 结果: 单核细胞经PMA及oxLDL共同孵育后，细胞内形成大量脂滴，胆固醇酯(CE)和细胞内脂质过氧化产物(MDA)含量由(3.4±0.6) mg/L, (0.43±0.07) nmol/L升至(64.8±6.8) mg/L, (8.50±1.23) nmol/L (P<0.05)，泡沫细胞由(4.7±2.2)%升至(77.8±7.0)% (P<0.05)，而PPAR?γ mRNA和PPAR?γ,小凹蛋白?1蛋白表达由（4.4±0.8）, （0.5±0.09）, （0.6±0.09）降至（1.6±0.4）, （0.33±0.09）, （0.33±0.09）(P<0.05)，苦参碱低、中、高干预组细胞内积聚的CE和MDA含量分别为 (29.7±4.9) mg/L, (1.92±0.46) nmol/L, (5.8±1.3) mg/L, (0.6±0.08) nmol/L, (3.4±0.6) mg/L, (0.43±0.07) nmol/L;泡沫细胞为(46.2±5.8)%, (16.3±3.4)%, (4.8±1.5)%, PPAR?γ mRNA和PPAR?γ, 小凹蛋白?1蛋白表达为（6.4±2.2）, （0.6±0.08）, （0.5±0.09）, （7.4±2.2）, （0.6±0.08）, （0.6±0.07）, （8.6±2.7）, （0.6±0.06）, （0.7±0.06），与ox?LDL+PMA组比较有显著性差异(P<0.05). 结论: 苦参碱减少ox?LDL诱导的单核细胞源性泡沫细胞的形成及细胞内胆固醇聚集，增加泡沫细胞内PPAR?γ,小凹蛋白?1的表达.

【关键词】  苦参碱;泡沫细胞;过氧化增殖物激活型受体?γ;胆固醇;小凹蛋白?1

　　0引言

　　动脉粥样硬化一个重要的特征是单核细胞进入损伤的动脉壁进而分化为巨噬细胞. 这些巨噬细胞吞噬大量的脂质变为泡沫细胞［1］. 在人类和小鼠粥样斑块损伤中可见过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR?γ)明显表达，提示PPAR?γ在动脉粥样硬化中起重要作用. 小凹蛋白?1(caveolin?1)具有结合和运载胆固醇的功能,并促进细胞内游离胆固醇流出,对维持正常细胞胆固醇的稳态起着重要调节作用［2］. 苦参中的活性成分苦参碱（Matrine）具有较为广泛的生物学作用［3］. 但其抗动脉粥样硬化的机制目前尚不清楚. 本实验我们以ox?LDL诱导的单核细胞形成的泡沫细胞为实验模型,观察苦参碱对胆固醇脂,PPARγ,小凹蛋白?1表达的影响，进一步探讨苦参碱在动脉粥样硬化发病机制中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料RPMI?

　　1640培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自天津市正江高科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA), 佛波酯（PMA）, 油红O, 靛蓝胭脂红, 胆固醇氧化酶, 胆固醇酯酶均购自Sigma公司；胆酸钠美国Amresco公司. 胆固醇购自GourMet Cell Application公司；苦参碱(一种生物碱,具有四环的喹嗪啶类结构，熔点75.5~77.5℃,纯度99%, 溶于水),批号为20040625，分子质量248.36，宁夏中药厂提供.

　　1.2方法

　　健康人血浆购自宁夏中心血站，按照常规方法分离、提纯，提取的LDL以含0.1 g/L EDTA的Tris?HCl缓冲液(pH 7.6) 4℃透析48 h,过滤除菌,考马斯亮蓝G?250法定量蛋白. 在分组干预时，使苦参碱终浓度达到以下分组的浓度［4］：①对照组：对细胞没有任何干预；②ox?LDL+PMA组：培养细胞中加入终浓度为0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的ox?LDL; ③苦参碱低剂量组：培养细胞中加入终浓度为0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的ox?LDL, 2.5×10-4 mol/L的苦参碱；④苦参碱中剂量组：培养细胞中加入终浓度为0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的ox?LDL, 5×10-4 mol/L的苦参碱；⑤苦参碱高剂量组：培养细胞中加入终浓度为0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的ox?LDL,1×10-3 mol/L的苦参碱，各组继续培养48 h.

　　按［5］用荧光分光光度法测定各样品的胆固醇浓度，测定游离胆固醇时，反应液中省去胆固醇酯酶，胆固醇酯的含量用总胆固醇与游离胆固醇的差值获得. 按照MDA测定试剂盒说明书的方法，检测MDA的含量及活性. 显微镜下观察，细胞内脂质呈红色，细胞核呈蓝色. 400倍光镜下非重复计数100个细胞，计出泡沫细胞所占的数量. 按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，提取的RNA溶于适量DEPC水中，备用. 逆转录总反应体系为50 μL,总RNA 10 μg, oligdT 2 μL,混匀短暂离心,70℃预变性10 min,冰浴5 min;加入MMLV逆转录酶2 μL, RNasin 1 μL, dNTP 2 μL, MMLV缓冲液10 μL 40℃逆转录60 min, 94℃ 5 min灭活逆转录酶. 荧光定量PCR引物序列资源自GenBank序列数据库. 根据基因的相对量=2-△△Ct，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，△△Ct=［CtGI（待测样品）-CtGAPDH（待测样品）］-［ CtGI（校正样品）-CtGAPDH（校正样品）］. GI是目的基因，校正样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于管家基因的定量.

　　按文献方法［6］,待测样品用BCA试剂测定蛋白含量后蛋白浓度以BCA法测定. 采用BioRad Quantity 4.5.2软件分析测定其区带的感光密度,以βactin为内参照,用目的片段与βactin的光密度比值表示蛋白质表达水平.

　　统计学处理: 各样本测定值以x±s表示，行方差分析(ANOVA)及多样本均数的两两比较(LSD). 组间方差不齐时,采用非参数秩和检验,用SPSS 11.0统计学软件进行分析,P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1苦参碱对激活的人单核细胞内胆固醇积聚及脂质过氧化的影响

　　经ox?LDL处理后单核细胞内TC,FC,CE及MDA的含量均增加（P<0.05），苦参碱可减少ox?LDL+PMA所致的单核细胞内TC,FC,CE及MDA的含量的增加（P<0.05），但苦参碱低剂量组仍高于对照组(表1).表1各组人单核细胞内胆固醇的积聚及脂质过氧化产物的比较(略)

　　2.2苦参碱对单核细胞泡沫化的影响

　　各组泡沫细胞的半定量结果如图1，单核细胞的泡沫化形成如图2，经LDL+PMA处理后油红O染色阳性细胞的百分计数均显著增加（P<0.05）， 苦参碱可显著缓解LDL+PMA所致的阳性细胞的增加（P<0.05），但苦参碱低剂量组仍高于对照组.

　　2.3泡沫细胞PPARγ mRNA,蛋白表达和小凹蛋白1蛋白表达的变化

　　经LDL+PMA处理后单核细胞内PPARγ mRNA和PPARγ,小凹蛋白?1蛋白表达均下降（P<0.05），苦参碱可增加PPARγ mRNA和PPARγ,小凹蛋白1蛋白表达（P<0.05），苦参碱剂量组与对照组比较无统计学差异(图3,4).

　　3讨论

　　AS的病因及发病机制尚不完全清楚,研究表明,巨噬细胞胆固醇的聚集和泡沫细胞形成贯穿了AS的整个过程［7］. 抑制caveolin?1的表达可以使细胞内胆固醇流出受阻,从而加剧胆固醇和胆固醇脂的堆积,加重细胞泡沫化和动脉粥样硬化. PPAR?γ主要参与脂代谢相关基因的转录基因调节,可促使脂肪细胞分化. 研究显示,单核巨噬细胞分化为泡沫细胞最突出的特征是脂代谢变化,但调节脂代谢相关基因表达的PPAR?γ对血管局部单核巨噬细胞的作用知之甚少.报道［8］对体外细胞培养研究表明,在人巨噬细胞及巨噬细胞源性泡沫细胞,配体活化的PPAR?γ通过caveolin?1基因表达降低和ApoAI介导的胆固醇流出途径减少胆固醇酯合成,结果提示PPAR?γ在AS起重要作用.

　　我们研究发现，oxLDL＋PMA共同孵育的单核细胞明显泡沫化,单核细胞内TC,FC和CE均显著增加，而且细胞内MDA也明显增多，这与以前的研究一致［9］. 在有苦参碱存在时,泡沫细胞内积聚的TC, FC和CE均明显地减少; MDA以及泡沫细胞的数量均显著减少；同时单核细胞PPARγ mRNA和PPARγ,小凹蛋白?1蛋白表达增加,这些结果说明,苦参碱可能作用于胆固醇逆转运过程的起始步骤,苦参碱一方面抑制胆固醇酯化, 使胆固醇流出;另一方面苦参碱使PPARγ表达上调,同时PPAR?γ能使单核巨噬细胞转分化过程中小凹蛋白?1蛋白表达水平明显增加, 小凹蛋白?1主动转出胆固醇增加,从而细胞内胆固醇聚积减少. 提示苦参碱可能通过PPARγ小凹蛋白1表达增加抑制AS 提前发生.

　　本实验结果显示苦参碱可能增强了PPARγ mRNA和PPARγ,小凹蛋白1蛋白表达，导致中泡沫细胞内积聚的TC, FC与CE减少；从而达到和预防动脉粥样硬化的作用,但苦参碱如何调控PPAR?γ,小凹蛋白?1的机制有待进一步研究.

【文献】
  　［1］Fong IW. Infections and their role in atherosclerotic vascular disease［J］.J Am Dent Assoc, 2002, 133(Suppl):7s-13s.

　　［2］Ge S, Pachter JS.Caveolin?1 knockdown by small interfering RNA suppresses responses to the chemokine monocyte chemoattractant protein?1 by human astrocytes［J］.J Biol Chem, 2004,279(8):6688-6695.

　　［3］王俊学,王国俊.苦参碱及氧化苦参碱的药理作用及临床应用［J］.肝脏,2000,l5(2):116-117.

　　［4］Zeng XK, Dai J, Remick DG, et al. homocysteine mediated expression and secretion of monocyte chemoattractant protein?1 and interleukin?8 in human monocytes［J］.Circulation Research,2003,9(3):311-321.

　　［5］蒋佩, 严鹏科, 莫中成, 等. 促进细胞内胆固醇流出抑制单核细胞源性泡沫细胞凋亡［J］. 病理生理杂志, 2005, 21(6): 1041-1045.

　　［6］高雪,薛莹,姜泓,等. 结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化［J］.第四军医大学学报, 2004,25(18):1637-160.

　　［7］王宗仁,郑瑾,马爱玲，等.中药芪丹通脉片对动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞及PAI21表达影响［J］.第四军医大学学报, 2004,25(14):1290-1293.

　　［8］Plenz GA, Hofnaqel O, Robenek H. Differential modulation of caveolin?1 expression in cells of the vasculature by statins ［J］. Circulation,2004,109(2):e7-e8.

　　［9］唐朝克,杨永宗. LXR和ABCA1对体内胆固醇代谢的调节作用［J］. 生命的化学,2003,23(5):381-384.