神经干细胞的研究进展及前景展望
【关键词】 神经干细胞；增殖；移植
神经组织的再生是困扰医学界的难题之一，近年来家发现成人中枢和外周神经系统中都有神经干细胞（neural stem cell, NSC）的存在，但大部分NSC处于静止状态，从体内分离、激活NSC，具有非常广阔的生物学研究和临床应用前景，已成为中枢神经系统损伤和疾病研究的焦点。本文拟就NSC研究的最新进展及其应用前景综述如下。
1 NSC的分布
1992年Reynolds等［1］和Richards等［2］先后从成年鼠的纹状体和海马中分离出NSC,首先打破了成体哺乳动物神经细胞不能再生的传统观念。成体哺乳动物中枢神经系统中存在两个NSC聚集区：侧脑室壁的脑室下层(sub ventricular zone, SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(sub granular zone, SGZ)［3］。用免疫荧光标记SVZ的干细胞，在活体可以清晰地观察到增殖的细胞从脑室迁移到嗅球的轨迹［4］；SGZ的干细胞则发育形成颗粒细胞,并与海马齿状回建立突触联系［5］。在人胚NSC的研究，已从大脑皮层、海马、纹状体、嗅球、脑室沿线包括侧脑室、第三脑室和第四脑室、间脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜中分离得到NSC，或具有比NSC更明确方向的神经祖细胞。
2 NSC的基本生物学特性
Mckay［6］于1997年提出，NSC是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。其生物学特性主要有以下几方面。
2.1 自我更新 NSC具有高度增殖和自我更新以维持自身数目恒定的能力。通过两种方式实现,对称分裂：干细胞分裂产生的两个子细胞都是干细胞；不对称分裂：干细胞分裂产生一个干细胞和一个分化的子代细胞,后者最终分化为终末细胞。NSC增殖，互相聚集成神经球,根据大小和培养的时间，神经球可含有NSC、正在分化的神经前体细胞、凋亡细胞,甚至已分化的神经元和胶质细胞等。NSC继续增殖,则生长出许多子代的神经球［7］。Vescovi等［8］报道,NSC可在体外持续传代达3年以上，分裂后的子代干细胞具有与母代干细胞完全相同的生物学特性。
2.2 多潜能分化 NSC分化后可形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,其分化与局部微环境密切相关。目前NSC的诱导分化可通过生长因子诱导、基因调控及信号传导通路调节等途径。
2.3 迁移功能和良好的组织融合性 在人类和哺乳动物神经系统发育过程中, NSC沿着发育索方向迁移。移植后的NSC同样具有迁移能力,且受病变部位神经源性信号的影响,移植后的NSC具有向病变部位迁移的趋化性,并分化成特异性细胞［9］。脑室内移植的NSC可以通过血脑屏障,迁移至脑实质中与宿主细胞在形态结构和功能上形成初步良好的整合,参与宿主神经形成。
2.4 高度未分化状态及低免疫原性 NSC增殖能力处于较原始的未分化状态,呈巢蛋白(nestin)阳性,缺乏已分化细胞的抗原标志,无成熟细胞相应的特异性标志，不表达成熟细胞的抗原,具有低免疫原性,在移植后较少发生异体排斥反应,利于其存活［10］。
2.5 转分化和去分化 Bjornson等［11］发现小鼠NSC植入同种异体血管内可逆转分化成血细胞。Clarke等［12］将Lac-z标记的小鼠NSC移入鸡和小鼠囊胚中,可逆转分化成为内中外3个胚层,经研究证实利用NSC可实现跨胚层分化,如分化为骨骼肌细胞及造血系统的各系细胞等。但随着研究的深入,越来越多的科学实验发现的事实和成体组织中存在成体干细胞的证据,向“横向分化”、“跨胚层分化”学说等提出质疑, Nature(2004)刊登了两个不同实验室的2篇论著 ［13,14］，各自用充分的事实证明,输注的CD34+造血干细胞到达损伤的心肌部位却仍然分化为CD45+造血细胞,而没有变为心肌细胞的任何证据。
3 NSC的来源、分离、培养及鉴定
3.1 NSC的来源 NSC主要从以下几种途径获得：(1)来源于神经组织［15］;(2)来源于胚胎干细胞、胚胎生殖细胞等细胞的定向诱导分化［16］;(3)来源于血液系统的骨髓间质干细胞［17］、成年多能祖细胞［18］及脐血细胞［19］;(4)来源于永生化细胞系 C17-2细胞系［20］（由新生小鼠小脑外颗粒层细胞通过逆转录病毒转导V-Myc后获得的克隆多能干细胞系）、MHP36细胞系［21］（从转导温度敏感型tsA58原癌基因的转基因小鼠的海马增殖区获得，是一种温控型NSC。在体外33℃时增殖，在体内较高温度37℃时分化成神经元和胶质细胞）、NT2细胞系［21］（从人睾丸生殖细胞肿瘤中获得，在维甲酸的诱导下表现出NSCs的特性）;(5)体核细胞转移技术获得NSC ［22］。
3.2 NSC的分离纯化方法 目前建立起的NSC的分离方法有：（1）反复传代法。取3～4个月龄的人胚胎纹状体或孕 14～16天小鼠、大鼠胚胎大脑，机械分离制作单细胞悬液。在含多种神经因子的无血清培养基中培养，实现NSC的体外稳定有效扩增。经过长期培养反复传代可使NSC得到纯化。（2）流式细胞术。Sasaki等［23］采用流式细胞仪对约60种细胞表面抗原进行筛选，结果发现分选出的具有CD133+/CE34+/CD45-（细胞表面抗原）的细胞为NSC。（3）基因转导。Keyoung ［24］等利用腺病毒为载体,将置于归巢素和Msi1增强子和启动子控制下的绿色荧光蛋白基因导入人胚胎细胞,然后对胚胎细胞进行体外培养,只有NSC能特异性地出现绿色荧光蛋白。再利用流式细胞仪进行荧光筛选,能进一步将NSC收集起来。（4）免疫磁珠细胞分选法。利用磁珠表面的特异性抗体与NSC表面抗原结合，在磁场作用下使结合磁珠的NSC与其他细胞分离，从而得到较纯化的NSC。
3.3 NSC的鉴定 巢蛋白(Nestin)是一种神经元中间丝蛋白［25］,其表达始于神经胚形成时,当NSC迁移基本完成,巢蛋白的表达量逐渐减少,并随NSC分化的完成停止表达。免疫组化证实NSC均呈Nestin阳性。Okano等［26］鉴定出一种RNA结合蛋白即 Musashi ,可作为NSC的标志物。对分离培养得到的NSC进行标记时发现,Nestin和Musashi呈双重阳性,且随着NSC分化成为神经元,二者的标记作用也消失,说明Musashi具有与Nestin相似的特异性和种间保守性。Nestin和Musashi作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSC的鉴定。
4 NSC的应用前景
4.1 NSC原位诱导 内源性NSC的自身激活。大量体外和在体实验已经证实成年脑中存在NSC。研究影响NSC增殖和分化的信号作用的实验［27］证实,脑室管膜下区等部位的NSC在脑损伤发生后能够增殖、迁移到受损部位并分化成新的神经细胞，取代受损脑组织细胞。在大多数情况下,仅由内源性干细胞产生的神经组织可能不足以替代损伤后缺失的神经组织,尤其在脊髓、纹状体等神经组织发生很少的部位［28］。可能原因有：(1)原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和特定细胞因子的作用。(2)患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活。
4.2 异体神经干细胞移植 临床试验表明,移植胎儿脑组织治疗神经系统退行性疾病可以明显改善症状。但胎脑的来源有限,受伦理和上的束缚,限制研究的发展。NSC的发现和体外分离培养,为中枢神经系统疾病的细胞替代疗法拓宽了道路。在体外培养扩增的NSC移植到脑疾病动物模型脑内的实验［29］表明,体外培养的NSC移植到脑内后能够迁移分化为特定部位的神经细胞,其分化方向与所处的微环境密切相关。Vescovi等［30］在研究细胞移植治疗帕金森病时发现,在体外实验中没有必需的因素干预下, NSC分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5%～5%。因此,诱导NSC向修复所需的神经功能(目的)细胞分化成为研究的核心问题。
4.3 基因治疗 基因治疗是通过特定载体相关外源基因导入体内,使其获得表达,达到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。目前神经系统基因治疗常用的靶细胞有：(1)成纤维细胞,来自间充质,能在体外分裂增殖,具有较高的病毒感染率但植入脑后不能与宿主整合；(2)永生化神经祖细胞,体外容易进行基因转导和能与宿主整合等优点,但存在致癌的危险；(3)NSC来源于神经组织,比永生化NSC更能保持原有的生物学特性,具有分化能力和更好的组织相容性,可以整合到宿主脑组织并向周围迁移,不形成肿瘤等。
4.4 NSC的其他应用 NSC具有稳定的生物学性状,建系以后可以获得均一的遗传背景,具有组织和种属特异性，可作为神经系统疾病的药物筛选平台。利用NSC的多向分化潜能,可筛选出控制和促进NSC向终末细胞分化的药物。另外,利用携带报告基因的逆转录病毒转染脑内可增殖细胞来追踪神经前体细胞的分布、增殖分化和迁移情况,研究中枢神经系统的发育过程。
5 问题与展望
NSC为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径，但中枢神经系统的再生是一个十分复杂的课题。在将NSC用于临床前,还需做大量的前期工作,如NSC在体外大量扩增时较难保持其未分化状态，无法满足干细胞移植所需。培养NSC需要大量昂贵的细胞因子，制约了NSC的临床应用。本课题组利用饲养层平台培养NSC，利用饲养层分泌的细胞因子维持其未分化状态，达到低耗高效培养NSC目的。另外，使用的动物模型尚不十分完善,神经干细胞移植后与宿主神经元是否建立了真正的突触联系,从而参与宿主神经的形成,目前尚无确切证据。NSC增殖、分化、迁移以及与组织结构融合的细胞内、外环境调节控制机制尚不十分清楚,对移植后NSC迁移速度、分化方向尚缺乏十分有效的调节手段,任何使神经干细胞向着预想的方向分化的手段将继续成为关注的热点。虽然NSC研究还处于起步阶段,但已在医学领域中呈现出诱人的光辉前景,我们相信终有一天随着上述问题的解决,它在神经系统方面乃至整个生命医学上的价值将得到体现。
【】
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