葡多酚对体外培养肝细胞PKC表达影响
【摘要】 目的 体外观察葡多酚(GPC)对小鼠肝细胞蛋白激酶C(PKC)表达的影响。方法 将正常小鼠肝细胞加入不同剂量GPC共同培养后，用免疫细胞化学法检测各组肝细胞PKC表达；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测各组肝细胞的增殖活性。结果 100mg/L GPC组肝细胞内PKC阳性表达率和细胞增殖活性分别为34?24%和0?654±0?062，经统计学χ2检验和t检验，与正常对照比较差异均有统计学意义(P<0?05)。结论 葡多酚可促进小鼠肝细胞PKC表达，提高肝细胞增殖活性。
【关键词】 葡萄原花青素
葡多酚，又称葡萄原花青素(grape procyanidins,GPC)，是从葡萄籽中提取的天然多酚类物质。据国内外报道，GPC不仅具有清除自由基、抗氧化等生物学功效，还能促进多种细胞的增殖活性〔1-3〕。本实验采用体外细胞培养，研究不同剂量GPC对小鼠肝细胞PKC蛋白表达的调控作用，探讨其与细胞增殖活性的关系。
1 材料与方法
1?1 材料
1?1?1 GPC样品 使用溶剂浸提法从葡萄籽中制取，含量>95%；标准品(日本岛田株式会社)。
1?1?2 试验动物 山东省实验动物中心提供的昆明小鼠，体重18～20g。
1?1?3 主要试剂与仪器 一抗小鼠PKC单克隆抗体(简称一抗)(武汉博士德公司)；二抗山羊抗小鼠IgG抗体HRP(简称二抗)(北京中杉金桥公司)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德公司)；PKC一抗工作浓度为1：50；RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；新生牛血清(奥地利PAA公司)；显微镜与照相机(日本OLIMPUS公司)；酶标仪(美国BECKMAN公司)。
1?2 实验方法
1?2?1 肝细胞悬液的制备 将新鲜小鼠肝组织剪碎，过100目不锈钢网，3层无菌沙布过滤，1000r/min离心10min，弃上清，加磷酸盐缓冲液(PBS)1000r/min离心10min，制成细胞浓度为1×106、细胞活力>95%的肝细胞悬液备用。
1?2?2 PKC蛋白的表达 将上述细胞悬液培养于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，将盖玻片置于6孔板培养皿中，加入终浓度10，50，100mg/L的GPC，空白对照加入RPMI1640，置37℃、5% CO2培养箱培养24h，取出盖玻片，肝细胞经4%多聚甲醛固定10min。用免疫细胞化学法按检测试剂盒说明检测肝细胞中PKC蛋白的表达〔4〕：10%H2O2灭活内原性过氧化物酶，5%小牛血清蛋白(BSA)封闭液室温20min，加入一抗，二抗(DAB)显色，苏木素-伊红(HE)染色，脱水，透明和封片。高倍(×400)显微镜下观察PKC蛋白的表达水平。选择细胞清晰的视野视察，在每个组观察2500个肝细胞记录其中的阳性细胞数。根据公式：PKC蛋白阳性表达率=PKC阳性细胞数/计数细胞总数×100%阳性表达率。
1?2?3 MTT法测定各组小鼠肝细胞的增殖活性 将肝细胞悬液接种于96孔培养板，每孔0?1ml，加入终浓度10，50，100mg/L GPC，置37mg/L GPC，置37℃、5%CO2培养箱培养24h，用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法在波长492nm测定细胞增殖活性，用吸光度(A)值表示。根据公式计算GPC对小鼠肝细胞增殖的促进率：促进率(%)=(GPC组-正常对照组)/正常对照组×100%。
1?2?4 统计分析 采用SPSS11?0统计软件进行t检验和χ2检验。
2 结果
2?1 PKC蛋白的表达结果 PKC蛋白在细胞内为胞浆表达，光镜下呈现棕黄色颗粒。 本实验结果可见，100mg/L GPC组细胞浆内棕黄色颗粒的细胞多、颜色深，为PKC蛋白强表达(图1)，正常对照组胞浆内表达的细胞数少、染色浅，为弱表达(图2)。2组的阳性表达率分别为34?24%和12?72%经χ2检验，差异有统计学意义(P<0?05)。10，50mg/L GPC组PKC表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0?05)，见表1。
2?2 增殖活性检测结果 100mg/L GPC组的增殖活性分别为(0?654±0?062)，正常对照组的增殖活性为(0?405±0?126)，经t检验，两者差异有统计学意义(P<0?05)。10，50mg/L GPC组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0?05)，见表2。
图1 高剂量GPC组PKC强表达(DAB×200)（略）
图2 低剂量GPC组PKC弱表达(DAB×2000)（略）
表1 各组PKC蛋白的表达（略）
注：与正常对照组比较，*P<0.05
表2 各组小鼠肝细胞增殖活性（略）
注：与正常对照组比较，*P<0?05
3 讨论
本研究显示，100mg/L GPC组PKC蛋白表达水平较正常对照组显著升高，且呈现随GPC剂量的升高，PKC阳性表达率逐渐升高的明显剂量-反应关系，表明GPC可激活PKC，使PKC蛋白表达水平上升，增强细胞内信息传递与细胞活化的影响，促进细胞的增殖分裂。本研究结果表明，GPC对肝细胞的增殖活性有促进作用，与报道GPC可促进细胞增殖活性的结果相一致〔5〕，也同本实验的PKC结果相吻合。综上所述，GPC可提高肝细胞PKC表达水平，对肝细胞增殖活性有促进作用。同时提示，GPC对肝细胞增殖活性的促进作用可能是通过对PKC调控而实现的。
【文献】
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〔4〕 李亚丽，马克里，邹伟，等.磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2过表达对大鼠肝癌细胞不同亚型蛋白激酶C表达及转位的影响［J］.中华肝脏病杂志，2005，13(9)：678-681.
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