抗坏血酸对细菌脂多糖引起发育毒性保护作用

【摘要】  目的 研究抗坏血酸(AA)对细菌脂多糖(LPS)引起宫内胎儿死亡(IUFD)、生长发育迟缓(IUGR)和骨骼发育迟缓的保护作用。方法 实验1：LPS组小鼠于妊娠第15～17d经腹腔注射LPS,LPS+AA组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射给予AA，对照组给予等容量的生理盐水或AA。所有孕鼠于妊娠第18d处死。实验2：LPS组小鼠于妊娠第16d注射LPS，LPS+AA组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射给予AA，对照组给予等容量的生理盐水或AA。LPS处理后6h处死孕鼠。结果 LPS+AA预处理组平均每窝死胎数明显低于单纯LPS处理组，LPS+AA后和预+后处理组平均每窝死胎数与单纯LPS组比较差异无统计学意义；AA预、后和预+后处理均显著抑制LPS引起IUGR和枕骨骨化不全。AA预和后处理均显著抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化，但AA预处理的作用强于后处理。结论 AA预处理通过抑制LPS引起的氧化应激，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓；AA后处理和预+后处理对抗LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起的IUFD无明显保护作用。

【关键词】  细菌脂多糖

     
　　细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性细菌细胞壁结构中的类脂多糖，广泛存在于人和动物的消化道内〔1〕。LPS引起的胚胎吸收、宫内胎儿死亡(intra?uterine fetal death,IUFD)和早产已经得到证实〔2〕。本课题组前期研究发现，母鼠妊娠晚期接触LPS引起胎儿宫内生长发育迟缓(intra?uterine growth retardation，IUGR)和骨骼发育迟缓，活性氧(ROS)可能参与了LPS引起的胚胎发育毒性〔3,4〕。抗坏血酸(AA)是重要的水溶性抗氧化剂，本文重点探讨AA对LPS引起小鼠IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓的保护作用。

　　1   材料与方法

　　1?1   试剂   细菌脂多糖(EschericlSia coli LPS,serotyoe 0127：B8)和抗坏血酸(ascorbic acid，AA)(美国Sigma公司)。

　　1?2   动物及实验方法   清洁级ICR小鼠(7～8周，雄性30～32g，雌性26～28g)(北京维通利华实验动物公司)。实验前适应性喂养1周(自由饮食，昼夜均衡，温度20～25℃，湿度(50±5)%。交配时，按2∶4(雄∶雌)于21：00合笼，次日7：00检查雌鼠阴栓，查到阴栓者定为妊娠第0d。分2个实验。实验1：孕鼠随机分为单纯LPS处理组，LPS+AA预、后和预+后处理组及对照组，所有孕鼠均于妊娠第15～17d给药。单纯LPS处理组仅注射LPS(75μg/kg，ip)；LPS+AA预处理组孕鼠注射LPS前0?5h给予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA后处理组孕鼠注射LPS后3h给予AA(500mg/kg,ip)；LPS+AA预+后处理组孕鼠注射LPS前0?5h和后3h各给予500mg/kg的AA；对照组给予等容量生理盐水或AA。所有孕鼠于妊娠第18d处死，记录活胎、死胎、吸收胎数和流产数，秤量活胎体重，测量身长和尾长，并评价活胎鼠骨骼发育情况。实验2：分组同实验1，每组11只，所有孕鼠均于妊娠第16d给药。单纯LPS组仅注射LPS(75μg/kg，ip)；LPS+AA预处理组孕鼠注射LPS前0?5h给予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA后处理组孕鼠注射LPS后3h给予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA预+后处理组孕鼠注射LPS前0?5h和后3h各给予500mg/kg的AA；对照组给予等容量生理盐水或AA。LPS处理后6h处死孕鼠，取母肝、胎肝和胎盘，检测丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平。

　　1?3   氧化应激水平测定   用Griffith法〔5〕测定组织GSH含量。通过测定脂质过氧化的羰基产物MDA含量反映组织的氧化应激水平，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸反应底物(TBARS)比色法〔8〕。蛋白含量用Lowry法〔7〕测定。

　　1?4   统计分析   采用SPSS 12?0统计软件进行方差分析和两样本t检验。

　　2   结果

　　2?1   AA对LPS引起IUFD的影响   单纯LPS处理组平均每窝死胎数显著高于对照组［(0?1±1?1)与(8?2±2?0)，P<0?01］，LPS+AA预处理组平均每窝死胎数显著低于单纯LPS处理组［(3?1±4?5)与(8?2±2?0)，P<0?01］。LPS+AA后处理组(5?4±6?3)和预+后处理组(6?2±5?2)平均每窝死胎数与单纯LPS处理组(8?2±2?0)比较差异无统计学意义(P>0?05)。

　　2?2   AA对LPS引起骨骼发育迟缓的影响(表1)   母鼠妊娠晚期给予LPS引起胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化不全；AA预处理、后处理和预+后处理均显著抑制LPS引起枕骨、后掌(趾)骨骨化不全。

　　2?3   AA对LPS引起IUGR的影响(表2)   母鼠妊娠晚期给予LPS显著降低活胎体重、身长和尾长，AA预处理、后处理和预+后处理均显著抑制LPS引起IUGR。

　　表1   AA对LPS引起骨骼发育迟缓的影响（略）

　　注：e枕骨评分：1=正常，4=上枕骨未见骨化点；与对照组比较，a P<0?05，b P<0?01；与LPS组比较，c P<0?05，d P<0?01

　　表2   LPS和AA对宫内胎儿生长发育迟缓的影响（略）

　　注：与对照组比较，b P<0?01；与LPS组比较，d P<0?01

　　2?4   AA对LPS引起组织MDA水平升高的作用(表3)   母鼠妊娠晚期给予单剂量LPS，母肝、胎肝和胎盘组织MDA水平显著升高(P<0?01)。LPS+AA预处理组母肝、胎肝和胎盘组织MDA水平显著低于单纯LPS处理组(P<0?01)；LPS+AA后处理组胎肝和胎盘组织MDA水平明显低于单纯LPS处理组(P<0?05)，但母肝组织MDA水平与单纯LPS比较，差异无统计学意义(P>0?05)；LPS+AA预+后处理组母肝和胎盘组织MDA水平显著高于LPS+AA预处理组(P<0?01)。

　　表3   AA对LPS引起MDA升高的作用（略）

　　注：与对照组比较，b P<0?01；与LPS组比较，c P<0?05，d P<0?01；与LPS+AA预处理比较，e P<0?01

　　2?5   AA对LPS引起组织GSH降低的影响   母鼠给予单剂量LPS，母肝、胎盘和胎肝组织GSH含量分别为(22?5±2?1)，(3?70±1?60)，(12?4±1?2)nmol/(mg prot)，显著低于对照组(P<0?01)。AA处理后，母肝、胎肝和胎盘组织GSH水平进一步降低。

　　3   讨论

　　本研究结果显示，母鼠妊娠第15～17d经腹腔给予LPS，平均每窝死胎数显著增加。此外，LPS显著降低活胎平均体重、身长和尾长，并延缓胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化。结果表明，母鼠妊娠晚期接触LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。进一步研究发现,LPS+AA预处理组平均每窝死胎数显著低于单纯LPS处理组，AA预处理显著抑制LPS引起活胎平均体重、身长和尾长下降，并逆转LPS，引起的枕骨骨化不全。这些结果提示，AA预处理明显减弱LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。AA是重要的水溶性抗氧化剂。资料证实，AA能直接清除机体产生的氢氧自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O-·2)，预防氧自由基引起的氧化性损伤〔8〕。本研究发现，AA预处理显著抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化。结果提示，AA预处理可能通过清除LPS刺激机体产生的ROS，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。最近研究发现，AA具有双向作用，在有氧微环境下可通过自氧化反应产生去氢抗坏血酸负离子自由基(A-·)、O2-·和过氧化氢(H2O2)〔9〕，过多摄入AA或机体处于有氧状况下可诱导氧化应激并引起机体氧化性损伤〔10,11〕。本研究结果显示，AA后处理和预+后处理对LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化的拮抗作用显著弱于AA预处理。进一步观察发现，AA后处理和预+后处理显著减弱LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起IUFD无抑制作用。综上所述，AA预处理通过抑制LPS引起的氧化应激，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓；AA后处理和预+后处理显著减弱LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起IUFD无抑制作用。

【文献】
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