肠道致病菌多重PCR快速检测体系研究
1 材料与方法
1?1 实验菌株 肠炎沙门菌、阿柏丁沙门菌，鸡雏沙门菌，德尔比沙门菌、鼠伤寒沙菌，福氏志贺2a，福氏志贺2b，宋氏志贺菌，枸缘酸杆菌，变形杆菌，河弧菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌(四川省疾病预防控制中心)；产毒素大肠埃希菌C83921，产毒素大肠埃希菌C83902（兽医药品监察所）；侵袭性大肠埃希菌（中国生物制品研究所）。
1?2 试剂 染料、缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、核酸染料(GV)、琼脂糖、Marker等(北京塞百盛基因技术公司)。
1?3 主要设备 PCR基因扩增仪、台式高速离心机、紫外可见凝胶成像系统、核酸分析仪、微量加样枪(德国Eppendorf公司)；电泳槽、DYY-2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)。
1?4 方法
1?4?1 引物设计 沙门菌组氨酸转运操纵子基因片段具有沙门菌属特异性〔2-4〕，根据Genebank V01373提供的基因序列设计引物，即引物1:5′-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G-3′；引物2:5′-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3′由于ipaH基因存在于所有志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）的质粒和染色体上〔5〕，根据Genebank M32063提供的序列设计志贺菌和EIEC引物,引物序列为:引物1：5′- TGT ATC ACA GAT ATG GCA TGC -3′；引物2：5′- TCC GGA GAT TGT TCC ATG TG -3′。选择不耐热肠毒素(LT)的编码基因保守区〔6〕，根据Genebank S60731提供的序列设计一对引物为：引物1：5′-GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G-3′引物2：5′-AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C-3′。
1?4?2 DNA模板的提取 采用热裂解法，取细菌培养液1?0ml,置于Eppendorf管中,8000r／min，灭菌蒸馏水洗涤2次,最后用1ml蒸馏水悬浮,隔水煮沸10min,8000r／min，离心10min,取上清,即为DNA模板溶液。
1?4?3 多重PCR扩增条件的优化 通过多次试验先确定了变化较小的因素buffer,dNTP,再对影响较大的因素如MgCl2浓度、引物浓度、Taq酶用量、模板浓度，在1个范围内做正交实验，再进行局部微调，最后调整退火温度和循环数参数等。取PCR产物5μl及DNA Marker参照物在含有(GV)的1%琼脂糖凝胶中电泳，电压75V,电泳40min后在紫外灯下观察结果。
1?4?4 多重PCR体系的特异性、灵敏度、样品检测 (1)特异性检测：9株标准目的菌株和7株非目的菌株,提取DNA模板,然后进行PCR扩增，电泳后观察有无条带的出现。(2)灵敏度检测：将从目的菌株提取的DNA模板用核酸分析仪测定DNA含量,然后作10倍梯度稀释,取每个稀释度的DNA进行PCR扩增,电泳后观察条带的亮度,直到不出现扩增带为止。(3)样品的检测：从牛肉中分离的可疑菌株,提取DNA模板,进行多重PCR扩增。同时,按常规进行生化检验和玻板凝集试验。
1?4?5 PCR试剂盒组成 经反复试验,组装多重PCR试剂盒。包括PCR反应管,PCR反应液［染料，缓冲溶液（Mg2+），dNTP，引物］,琼脂糖粉,GoldView染料，Taq酶,阳性对照,阴性对照,液体石蜡。
2 结果
2?1 PCR反应条件的优化 反应体积50μl,10×buffer 5μl，引物各0?25μl（50μmol/L）,Taq聚合酶0?8μl(5U/μl),dNTPs 2μl（10mmol/L）,粗提DNA模板各1μl。扩增条件:94℃预变性4min,94℃变性45s,退火58℃40s,延伸72℃60s,32个循环，最后72℃保温5min，见图1。
1：肠炎沙门菌；2：阿柏丁沙门菌；3：鸡雏沙门菌；4：德尔比沙门菌；5：鼠伤寒沙门菌；6：产毒素大肠埃希菌C83902；7：产毒素大肠埃希菌C83902；8：福氏志贺2a；9：福氏志贺2b；10：宋氏志贺；11：侵袭性大肠埃希菌；12：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌；13：产毒素大肠埃希菌+福氏志贺2a；14：肠炎沙门菌+福氏志贺2a；15：福氏志贺2a+肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌；16：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌+福氏志贺2a；17：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌+福氏志贺2a
图1 多重PCR反应检测结果（略）
2?2 特异性 用所建立的方法检测沙门菌、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌均扩增出特异的、与预期结果相符的DNA片段,未见非特异性扩增带，且其他的非目的菌株未扩增出条带。
2?3 灵敏度 单独及多重PCR体系中几种菌的灵敏度均达到10-8fg/μl,两体系灵敏度一致,即沙门菌属为9?13×10-8fg/μl，志贺菌属（侵袭性大肠埃希菌）为7?23×10-8fg/μl，肠产毒素大肠埃希菌2?34×10-8fg/μl，见图2。
M：DNA Marker；1～4：各模板DNA稀释度分别为10-1，10-2，10-3，10-4倍
图2 多重PCR反应灵敏度检测结果（略）
2?4 牛肉中志贺菌的检测 用多重PCR方法从牛肉中共检测出9个阳性样品。经国家标准卫生检验方法验证均为阳性〔7〕。
2?5 试剂盒稳定性和重复性 除Taq酶,PCR反应液,阴、阳性模板置-20℃贮存外,其余试剂均4℃条件下贮存。在贮存时间为30，60，90，120，150，180，210，240，270和300d时取出,用已知PCR阳性样品检测试剂盒的稳定性,结果直到300d,样品PCR仍呈阳性,说明该试剂盒的有效期在300d以上。此外,PCR阳性样品用试剂盒重复试验3次,结果均为阳性;而PCR阴性样品重复试验3次,均为阴性。说明该试剂盒的重复性好。
3 讨论
本研究在于应用多重PCR快速检测肠道致病菌，考虑到引物间的配对、引物间的竞争性扩增、退火温度等均可影响多重PCR的扩增效果〔8〕，因此，查找的序列均具有很强的保守性，设计的3对引物之间不能相互配对，形成二聚体或发夹结构，Tm值基本一致等。对选取的目的菌株和非目的菌株同时进行PCR扩增,结果目的菌株均显示出特异扩增,而所有非目的菌株均不出现扩增条带,说明引物具有很强的特异性。多重PCR影响因素复杂,不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度及其比例、缓冲液成分与浓度、反应体系、循环参数等会产生复杂的综合效应〔９〕。本体系中10×buffer,dNTPs,模板量等对多重扩增的影响不大,Taq酶、引物、Mg2+浓度、循环次数、退火温度等对PCR反应的特异性和反应效率影响较大。通过优化PCR反应体系和条件,使实验效果达到了最佳，且几种细菌随机组合的扩增也获成功,未出现相互间强抑制现象。PCR试剂盒的稳定性和重复性试验表明,该试剂盒重复性好,有效期长,特异性强，灵敏度高，结果准确,对待检样品要求不高,检测时间更短等。通过对牛肉样品的检测,显示PCR法阳性率明显高于培养法,且培养法阳性的样品,PCR法均为阳性,说明试验结果可靠。因此,该试剂盒有一定的应用价值,可在生产生活中推广应用。
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