微波辐照对大鼠学习记忆行为和海马LTP影响

【摘要】  目的 研究微波辐照后学习记忆功能与长时程增强(LTP)改变的。方法 采用功率密度为65mW／cm2的微波全身一次辐照大鼠20min，在辐照后不同时相点观察大鼠学习记忆行为的改变(穿梭箱试验和Morris水迷宫试验)和海马离体脑片LTP的诱导变化。结果 微波辐照可导致大鼠肛温升高4?1℃，比吸收率（SAR）为12?0W／kg。微波辐照后0，24h，大鼠主动回避反应(AAR)明显低于辐照前(P<0?05)。微波辐照后0h和3h，大鼠寻找平台的潜伏期明显增加(P均<0?05)；空间搜索试验中辐照组大鼠在目标区域的游泳时间占整个游泳时间的百分比和跨跃平台次数均显著低于对照组大鼠(P均<0?01)。微波辐照后0，12，24h，3d，大鼠海马脑片LTP的诱导明显减弱(0h，P<0?01；12，24h，3d，P<0?05）。结论 在本实验条件下，微波辐照可导致大鼠空间学习记忆能力受损，海马脑区LTP的诱导障碍是大鼠学习记忆功能损害的细胞电生基础。

【关键词】  微波

   
　　随着微波技术的不断，应用领域越来越广，环境中电磁辐射水平较以往有较大提高〔1〕，给职业接触者和居民的健康带来潜在的危害。神经系统对微波辐射甚为敏感。以往的研究发现，在一定剂量下，微波辐照可致大鼠神经系统损伤，中枢神经系统(CNS)是微波辐照敏感的靶器官，海马脑区是重要的靶区。微波辐照可致实验动物学习记忆功能等神经行为障碍〔2〕。海马脑区与空间学习记忆功能高度相关，水迷宫试验主要检测动物的空间学习记忆能力。长时程增强(LTP)是公认的海马学习记忆的细胞突触模式，与整体学习记忆功能高度相关。因此，本研究观察了微波辐照对大鼠学习记忆等神经行为的变化与LTP的改变的联系，进一步阐明微波辐照致学习记忆功能障碍的变化规律和电生理学基础。

　　1  材料与方法

　　1?1  主要仪器  微波源(西安黄河厂)；HP8991A脉冲功率计(美国HP公司)；微电极放大器(MEZ-7300，日本Nihon Kohden公司）；示波器(SR-76，汕头仪器厂)；多通道电生理刺激器(南通电子总厂)；Morris水迷宫试验系统(医学院)；双向穿梭箱(本校生理教研室研制)。

　　1?2  主要试剂配制  人工脑脊液(ACSF)(mmol／L)：124 NaCl、5 KCl、2 MgSO4、1?25 NaH2PO4、24 NaHCO3、2 CaCl2、10 GS(葡萄糖，pH7?4～7?6)。

　　1?3  实验方法

　　1?3?1  实验分组  健康雄性Wistar大鼠54只(经训练筛选后用于正式试验的动物)，体重180～220g(第三军医大学动物实验中心提供)。主动回避反应试验和Morris水迷宫试验将大鼠随机分为2组：对照组(n=12)，微波辐照组(功率密度65mW／cm2，n=12)；2组在微波辐照后不同时相点进行相应的检测。脑片LTP的检测实验将大鼠随机分为2组：对照组(n=6)，微波辐照组(功率密度65mW／cm2，n=24)；微波辐照组又分为0，12，24h，3d 4个辐照后时相点，每个时相点6只动物。

　　1?3?2  微波辐照动物  动物辐照在微波辐照暗室内进行。环境温度(20±2)℃，湿度50％～70％。动物置于可透射微波的专用辐照盒内，在匀速旋转的实验平台上接受全身一次性辐照20min。

　　1?3?3  微波辐照对大鼠体温的影响  用热电偶点温计(精确度±0?1℃)测定在大鼠微波辐照前和辐照后即刻肛温，大鼠比吸收率(SAR)值。

　　1?3?4  主动回避反应(AAR)训练〔2〕  采用计算机控制的光信号刺激的双向穿梭箱，以灯光作为条件刺激，建立条件性穿梭反应，即AAR。动物每天连续训练20次，每次间隔为30s，连续训练8d，选取最后2d内习得率≥80％的动物用于实验。分别在微波辐照后0，12，24h和3d，再测试动物AAR。以上实验均在避光和安静环境中进行，其操作均由计算机自动控制和自动记录。

　　1?3?5  Morris水迷宫试验〔3〕  辐照前3d，每天训练大鼠，使其学会游泳并能熟练找到平台，剔除不会游泳和不能较快找到平台的大鼠，其余大鼠用于正式实验。辐照后每天分两段训练，每段训练4次，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线图、所需时间(潜伏期)及游泳速度。在第4d的训练后撤除平台，然后任选一个入水点将大鼠放入水中，让其自由游泳120s，测其在中心区域游泳时间占总时间的百分比和跨过平台相应位置的次数，并记录大鼠搜索平台的线路图。

　　1?3?6  大鼠海马离体脑片LTP的检测〔4〕  大鼠断头活杀，迅速分离左侧海马，顺海马槽纤维的走向连续切片，片厚400～450μm，迅速将其移至浴槽尼龙网上，随之保证持续的恒温ACSF灌流(32±0?5)℃和供氧(0?1L／min)。本实验记录的电活动是Schaffer侧枝-CA1区锥体细胞的场兴奋性突触后电位(fEPSP)。LTP=(刺激后斜率-刺激前斜率)／刺激前斜率×100％。

　　1?4  统计分析  采用Excel和SPSS11?0软件进行方差分析和t检验。

　　2  结果

　　2?1  微波对大鼠体温及SAR的影响  微波辐照后大鼠肛温为(41?0±1?6)℃，较辐照前(36?9±0?59)℃明显升高(P<0?001)。肛温升高达(4?1±1?4)℃，其SAR为(12?0±4?1)W／kg，提示存在明显的热效应。

　　2?2  微波辐照后大鼠学习和记忆功能的变化(表1)

　　表1  微波辐照后大鼠AAR的变化（略）

　　注：与对照组比较,*P<0?05,**P<0?01由表1可知，微波辐照后大鼠AAR降低。在辐照后0、24h，AAR明显低于辐照前，以辐照后24h AAR变化最明显(P<0?01)。提示微波辐照引起了大鼠学习记忆能力下降。

　　2?3  微波辐照后大鼠空间学习和记忆功能的变化(表2)  定位航行试验中，大鼠寻找平台的潜伏期(1atency)可以很好地反映大鼠的学习记忆功能。辐照组和对照组之间在辐照前3d的潜伏期差异均无统计学意义(P均>0?05)。由表2可见，微波辐照后0h和3h，大鼠寻找平台的潜伏期明显增加(P均<0?05)，辐照后24h和3d，两组动物之间潜伏期差异无统计学意义(P均>0?05)，但微波辐照组大鼠其潜伏期仍较对照组有增加的趋势。

　　表2  微波辐照后大鼠在定位航行试验中寻找平台潜伏期的变化（略）

　　注：与对照组比较,*P<0?05在微波辐照后的空间搜索试验(spatial probe test)中，120s自由游泳的数据记录显示，辐照组大鼠在目标区域的游泳时间占整个游泳时间的百分比(15?57±1?73)显著低于对照组大鼠(31?64±3?14)(P<0?01)；辐照组大鼠跨跃平台次数(1?33±0?52)明显少于对照组(5?40±1?67)(P<0?01)。定位航行试验游泳轨迹图显示，辐照组大鼠多沿四壁绕圈游动，4个象限侧重性不太强，而对照组大鼠大多集中在目标附近，反复来回寻找目标。实验表明,微波辐照后大鼠空间学习记忆能力明显受抑。

　　2?4  微波辐照后大鼠海马离体脑片LTP的变化  微波辐照后0,12，24h，3d，大鼠海马脑片LTP分别为(26?8±6?5)%，(32?0±6?2）%，(28?8±8?3）%，(29?1±11?9）%，均明显低于对照组（45?7±11?2)%，(0h，P<0?01；12，24h，3d，P<0?05)。提示微波辐照后大鼠学习记忆能力明显受损。

　　3  讨论

　　微波对健康的危害是多方面的，对中枢神经系统的影响特别受到国内外研究者的关注。微波对中枢神经系统的影响主要表现在神经行为的改变。如逆行性遗忘，空间参照记忆能力和空间学习效率以及操作能力明显受损，动物在开阔场试验的运动和探索行为以及防御条件反射的巩固受抑，甚至完全丧失应答能力等〔5-8〕。本实验结果显示，微波辐照大鼠后0h，无论是AAR，还是水迷宫试验中寻找平台的潜伏期均明显改变，表明在本微波辐照条件下大鼠的空间学习记忆能力严重受损，并且在3d之内没有完全恢复，说明动物的短时和长时学习记忆功能均减退，这可能与学习记忆相关的脑区结构受损有关〔9〕。本实验研究发现，大鼠海马离体脑片LTP的诱导在微波辐照后0h明显降低，并一直呈持续的抑制状态，直至辐照后3d仍未完全恢复，这与上述整体行为试验结果一致。表明微波辐照后大鼠学习记忆功能障碍与海马突触LTP诱导产生障碍有关。本研究动物在辐照前后体温升高幅度达4℃以上，SAR达到12W／kg。若按体温变化1℃或0?4W／kg(SAR)为区分热效应和非热效应的标准，本研究微波辐照引起了明显的热效应。热效应可能是微波辐照引起长时学习记忆功能障碍的始动因素。Akyel等研究发现，1?25GHz的脉冲微波辐照引起的大鼠操作行为障碍与热效应有关〔7〕。表明，微波辐照可影响大脑的电学活动〔10〕。由此推测，辐照初期微波的高频电磁场影响了突触正常的电生理活动，随着辐照时间的延长引起的高热效应导致海马突触结构损伤和神经元死亡，致使海马内神经通路和突触传递效能降低，从而影响海马LTP的形成，影响学习记忆功能。

【文献】
  　　〔1〕 张彦文，张广斌，田伟，等.某市环境电磁辐射水平的分布［J］.环境与健康杂志，2005，22(2)：93-96.

　　〔2〕 谢燕，宁竹之，索玉兰，等.微波对大鼠学习记忆行为的影响［J］.职业卫生与病伤，1997，12(2)：72-75.

　　〔3〕 D'Hooge R,Peter-P DD.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory［J］.Brain Research Reviews,2001,36:60-90.

　　〔4〕 胡志安，刘祚周，黎海蒂.一氧化氮对高频电刺激后海马长时程增强和c-fos表达的影响［J］.神经解剖学杂志，1999，15(3)：253-257.

　　〔5〕 Lai H,Horita A,Guy AW.Microwave irradiation affects radial-arm maze performance in the rat［J］.Bioelectromagnetics,1994,15(2):95-104.

　　〔6〕 Shtemberg AS,Uzbekov MG,Shikhov SN,et al.Species specificity,age factors,and various neurochemical correlates of the animal spontaneous behavior after exposure to electromagnetic field of the ultra low intensity［J］.Zh Vyssh Nerv Deiat Im I P Pavlova,2000,50(4):703-715.

　　〔7〕 Akyel Y,Hunt EL,Gambrill C,et al.Immediate post-exposure effects of high-peak-power microwave pulses on operant behavior of Wistar rats［J］.Bioelectromagnetics,1991,12(3):183-195.

　　〔8〕 D'Andrea JA,Thomas A,Hatcher DJ.Rhesus monkey behavior during exposure to high-peak-power 5.62-GHz microwave pulses［J］.Bioelectromagnetics,1994,15(2):163-176.

　　〔9〕 杨学森，龚茜芬，张广斌，等.电磁辐射对大鼠学习记忆和海马神经元的影响［J］.解剖学研究，2004，26(2)：91-94.

　　〔10〕 Krause CM,Sillanmaki L,Koivisto M,et al.Effects of electromagnetic fields emmited by cellular phones on the electroencephalogram during a visual working memory task［J］.Int J Radiat Biol,2000,76(12):1659-1667.