焦炉工人外周血淋巴细胞HSP 72表达特征
【关键词】 焦炉逸散物；多环芳烃；苯并(a)芘；热休克蛋白72；影响因素,
摘要： 目的 研究焦炉工人外周血淋巴细胞热休克蛋白72(HSP72)表达特征及其影响因素。方法 选取某焦化厂焦炉工人267人和对照30人，蛋白印迹(Western blot)法检测外周血淋巴细胞HSP72的表达，高效液相色谱法测定作业环境空气中苯并(a)芘〔B(a)P〕浓度。收集研究对象个人信息。结果 炉顶工、炉侧工外周血淋巴细胞HSP72表达水平(G±SG)(120±047，130±037)显著高于对照组(085±034)，炉侧工显著高于炉底工(101±035)，差异有统计学意义(P<005)。不同作业环境〔B(a)P〕浓度与相应作业区工人外周血淋巴细胞HSP72表达水平呈二项式分布(R2=09999)。Logistic分析显示，与对照组相比，焦炉逸散物暴露引起淋巴细胞HSP72表达阳性的调整OR为131，其中炉顶工、炉侧工调整OR分别为149和269。多元线性回归分析显示，在低暴露水平下(炉底工、对照组)，吸烟指数和饮酒是HSP72表达水平升高的抑制因素(β分别为-00001和-005，P<005)。结论 焦炉逸散物可诱导外周血淋巴细胞HSP72表达升高，但高暴露剂量为焦炉逸散物对HSP72表达有抑制作用。低暴露水平下吸烟和饮酒对HSP72表达有抑制作用。
关键词：焦炉逸散物；多环芳烃；苯并(a)芘；热休克蛋白72；影响因素
Expressive characters of HSP72 in peripheral blood lymphocyte of coke oven workers
Abstract： Objective To investigate heat shock protein 72 (HSP72) levels in peripheral blood lymphocytes of coke oven workers and influence factors.Methods Two hundred sixtyseven coke oven workers and thirty controls without occupational PAHs exposure were investigated.Benzo(a)pyrene〔B(a)p〕concentrations in the ambient air were assayed by high performance liquid chromatography(HPLC).HSP72 levels in peripheral blood lymphocytes were measured by Westem Blot.Personal information was collected by questionnaire.Results HSP72 levels in oven-top,oven-side workers(120±047，130±037) were significantly higher than that in control(085±034,P<0.05),and HSP72 levels in oven-side workers were significantly higher than those in oven-bottom workers(101±035，P<005).〔B(a)p〕 concentrations and HSP72 levels in different exposed groups showed binomial distribution(R2=09999).The logistic regression analysis showed that the coke oven workers had significantly higher risk in HSP72 rising(adjust OR=131)than control,and the adjust OR of oven-top，oven-side workers were respectively 149 and 269.Multiple linear regression result presented that in the lower exposure group(oven-bottom workers and control),smoking and drinking were inhibiting factors to HSP72 expression(the regression coefficient were respectively -00001 and -005,P<005).Conclusion The coke oven emissions can induce the rising of HSP72 expression.But the high dose coke oven emissions showed inhibition to HSP72.Smoking and drinking played an inhibitional role in HSP72 expression in lower exposure group.
Key words： coke oven emission;polycyclic aromatic hydrocarbons;benzo(a)pyrene;heat shock protein 72;influence factor
热休克蛋白是生物体细胞在一系列应激因素作用下产生的具有高度保守性的一组细胞保护性蛋白质，在生理状态下，它们主要发挥细胞内功能〔1〕，其中热休克蛋白70 (heat shock protein 70,HSP70)家族与细胞保护之间的关系最密切，它在机体细胞耐受形成、机体免疫调节、遗传物质保护、基因调控、细胞增殖分化、肿瘤发生等过程中起重要作用〔2，3〕。HSP70家族主要有诱导型的HSP72和结构型的HSP73两个亚型〔4，5〕，在应激过程中特别是染毒过程中，主要为HSP72表达变化〔6〕。本研究旨在通过分析焦炉工人外周血淋巴细胞HSP72表达特征，探讨焦炉逸散物对HSP72表达的影响，为焦炉工人的健康监护和预防保护提供理论依据。
1 对象与方法
11 对象 选取某焦化厂267名工人为研究对象，均为男性。根据作业环境和工作地点分为炉顶工80人，炉侧工64人，炉底工123人(含电工、瓦工、钳工、带运工、仪表工等)。30名对照选自2km外的某医护人员和管理人员，均为男性，无有毒作业接触史。
12 方法
121 调查方法 由调查员采用面对面询问的方式采集研究对象基本信息，填写调查表。内容包括性别、年龄、工龄、吸烟、饮酒、职业史、既往病史、生活环境、生活习惯、身体状况等信息。吸烟指数=吸烟支数/d×吸烟年限，吸烟指数>100为吸烟。
122 作业环境苯并(a)芘〔B(a)b〕测定 采用个体采样方法进行采样。分别选取炉顶、炉侧、炉底、辅助作业区(行政办公楼、回收车间、机电作业区)和对照区工人各2名，随身携带个体采样器(德国HSF513型)，流量2L/min连续采样6h，每个工作区重复测定2次。采用高效液相色谱法(Varian-Prostar高效液相色谱仪，美国Varian公司)检测〔B(a)P〕芘浓度。
123 淋巴细胞分离及处理 肘静脉采血5ml，肝素抗凝，加淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，2000r/min离心20min，吸取淋巴细胞层，生理盐水清洗，07%氯化氨裂解红细胞，离心分离淋巴细胞。加冰冷的细胞裂解液，4℃裂解1h,1000r/min离心5min，取上清，按DC protein assay试剂盒(美国BIO-RAD公司)方法进行总蛋白定量。调节蛋白浓度为1mg/ml,取100μl，加等体积2×十二烷基磺酸钠(SDS)100μl，94℃变性10min，用于HSP72的测定。
124 HSP72测定 蛋白印迹(Western blot)法〔7〕测定HSP72。取10μl样品和高分子量蛋白maker进行电泳和转膜(Mini-PROTEAN3型垂直电泳槽、Power PAC3000型电泳仪、小型Trans-Blot转印槽，(美国BIO-RAD公司)5%脱脂奶粉封闭，37℃振荡1h；兔抗人HSP72单克隆抗体(1：40000，美国stressgen公司)4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗15min，3次；辣根过氧化物酶标记的羊抗免1gG(1：10000，美国KPL公司)，37℃孵育1h，PBS洗清15min，3次；电化学发光剂(英国Amersham公司)显色，Kodak X-OMAT2000自动冲片机洗片，扫描，gel pro 32分析软件进行定量分析。HSP72表达水平用HSP72灰度值与对照样品灰度值的比值表示。
13 统计分析 应用SPSS100软件进行统计分析。单因素方差分析比较年龄、工龄组间差异，χ2检验比较吸烟、饮酒组间差异。HSP72对数转换后呈正态分布，用几何均数±标准差(G±SG)表示，多元协方差分析控制年龄、性别、工龄、吸烟、饮酒等因素的影响，比较组间差异。Logistic回归分析不同暴露等级引起HSP72升高阳性的危险度。
2 结果
21 一般情况 267名焦炉作业工人年龄为2135～4854岁，平均(3734±581)岁；工龄为117～2910岁，平均(1602±710)年；现暴露水平接触时间1～29年，平均(1182±769)年，吸烟人数182人，占6816%，饮酒人数132人，占4943%。30名对照年龄为2561～4336岁，平均(3603±557)岁；工龄为142～2510年，平均(1512±697)年，现暴露水平接触时间为1～25年，平均(1097±870)年；吸烟人数17人，占5667%；饮酒10人，占3333%。炉顶、炉侧、炉底工人及对照各组年龄、现暴露水平接触时间、吸烟率、饮酒率比较差异无统计学意义(P>005)。炉底和炉顶工人工龄差异有统计学意义(P<005)。
22 作业环境苯并(a)芘检测结果 炉顶、炉侧、炉底工作区B(a)P浓度分别为(035±002)，(010±000)和(0045±0007)μg/m3，分别是对照(002±000)μg/m3的175，5，225倍，呈现炉顶>炉侧>炉底>对照区的趋势。
23 焦炉工人外周血淋巴细胞HSP72表达水平
231 淋巴细胞HSP72表达水平(表1) 由表1可见，炉顶工、炉侧工淋巴细胞HSP72表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<005)，炉侧工显著高于炉底工，差异有统计学意义(P<005)，炉顶工与炉侧工比较，差异无统计学意义(P>005)。以各不同作业场所B(a)P浓度均值与该作业区工人HSP72表达几何均数进行曲线拟合，呈二项式分布，R2为09999，显示HSP72表达呈现随着〔B(a)P〕浓度的升高而先升高后下降的趋势。
表1 焦炉工人外周血淋巴细胞HSP72表达水平（略）
注：a与对照组比较，P<005；b与炉底工比较，P<005
232 暴露组别对HSP72表达水平的影响(表2) 以HSP72对数转换值为应变量，以年龄、工龄、现暴露水平接触时间、吸烟指数、饮酒、暴露组别为自变量进行多元线性回归分析，显示仅暴露组别对HSP72表达水平的变化有统计学意义(F=431，P<005)，其中炉顶工、炉侧工偏回归系数β分别为0082和0097，P<001，炉底工偏回归系数β为0042，差异无统计学意义(P>005)。该趋势与上述结果显示趋势一致。说明炉顶、炉侧焦炉逸散物引起焦炉工人处于应激状态，诱导HSP72表达水平升高，而炉底工处于基础或弱应激状态。
表2 多元线性回归分析淋巴细胞HSP72表达水平(对数转换值)影响因素（略）
233 淋巴细胞HSP72表达阳性的OR值(表3) 以对照组HSP72均值的95%CI上限值106为界值(≤106为阴性，≥106为阳性)，Logistic回归分析暴露引起HSP72阳性的危险度，扣除年龄、工龄、现暴露水平接触时间、吸烟、饮酒等因素的影响，暴露引起的HSP72表达阳性的调整OR为131(P<005)，说明焦炉逸散物暴露是引起HSP72表达升高的危险因素，其中炉侧工调整OR值为269(P<005)，在各组中最高。
表3 不同暴露组别焦炉工人淋巴细胞HSP72表达阳性的OR值（略）
24 吸烟、饮酒对淋巴细胞HSP72表达水平的影响(表4) 在吸烟和饮酒人群中，淋巴细胞HSP72表达水平呈现炉侧工>炉顶工>炉底工和对照的趋势，与表1显示趋势一致。其中，炉侧工与对照和炉底工比较，差异有统计学意义(P<005)，炉顶工与炉底工比较，差异有统计学意义(P<005)。而在不吸烟和不饮酒人群中，淋巴细胞HSP72表达水平则呈现随着暴露等级升高而升高的趋势，但各组之间差异无统计学意义(P>005)。根据〔B(a)P〕暴露水平，将焦炉工分为高暴露组(炉顶工、炉侧工)、低暴露组(炉底工)进行分层多元线性回归分析。在低暴露组，饮酒与吸烟指数偏回归系数分别为-005和-00001，显示对HSP72表达的抑制作用。在高暴露组，饮酒等各因素均未显示对HSP72表达的显著影响。
表4 吸烟、饮酒对焦炉工人淋巴细胞HSP72表达水平的影响（略）
注：与对照组比较，aP<005；与炉底工比较，bP<005；与炉侧工比较，cP<005
3 讨论
本文研究结果显示，〔B(a)P〕高暴露的炉顶工、炉侧工外周淋巴细胞HSP72表达水平明显高于低暴露的炉底工和对照，表明焦炉逸散物可诱导其表达水平升高。但随着〔B(a)P〕浓度的升高，炉顶工外周血淋巴细胞HSP72表达水平并没有呈线性升高，而是有回落的趋势，与外暴露〔B(a)P〕浓度呈二项式分布。多元线性回归分析各暴露组偏回归系数和Logistic回归分析各暴露组HSP72表达阳性的OR值均显示以上相同的趋势。焦炉逸散物中存在多种物质，有研究显示，高温、CO等因素均可诱导HSP72表达升高〔8〕。而体外细胞培养研究发现，随着〔B(a)P〕染毒剂量升高和染毒时间延长，细胞内HSP70、HSP72表达下降，表现为〔B(a)P〕对HSP70、HSP72表达的抑制作用〔9，10〕，可能是由于〔B(a)P〕的终代谢产物7，8-二羟基-9，10-环氧苯并(a)芘(BPDE)的亲电性使得BPDE容易与热休克因子(Heat shock factor,HSF)结合，从而影响其与热休克反应元件(Heat shock element,HSE)的结合，进而影响了HSP72基因的转录和表达〔6〕。因此，焦炉工人外周血淋巴细胞HSP72表达水平是多种因素相互作用的结果。高暴露如炉顶工HSP72表达下调可能与高剂量〔B(a)p〕表现的抑制作用有关。Xiao〔7〕研究了焦炉工人HSP70与细胞遗传损伤的关系，发现二者呈显著负相关，显示HSP70对焦炉逸散物引起的遗传损伤具有保护作用。因此，HSP72表达水平下调可能是一个危险信号，它一方面提示环境〔B(a)P〕浓度可能显著升高，另一方面，意味着机体耐受能力的下降，使得机体在高暴露损伤因素的作用下，产生更为严重的细胞损伤和遗传损伤。因此，对焦炉工人细胞HSP72表达水平的监测可用于评价工人暴露水平的变化和预示细胞损伤恶化的转折，为焦炉逸散物特别是〔B(a)P〕限量标准的制定提供依据。本研究也同时发现，吸烟、饮酒对HSP72的表达水平有一定的影响，但仅显示在低暴露情况下对HSP72表达的抑制作用，可能是焦炉逸散物特别是〔B(a)P〕对HSP72的表达的影响较大，掩饰了吸烟和饮酒的作用，提示对吸烟、饮酒的控制有利于改善机体的应激能力，其机制尚需进一步探讨。
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