大气污染物对大鼠肺炎性细胞因子影响

【关键词】  ,大气污染物；支气管肺泡灌洗液；细胞因子

　　摘要： 目的   研究大气污染物对大鼠肺炎性细胞因子的影响，探讨大气污染对呼吸系统炎性损伤的机制。方法   48只Wistar大鼠，体重200～240g，随机分为实验组(1d组、7d组和30d组)和对照组。实验组分别进行可吸入颗粒物(PM10)染尘，SO2、NO2和CO染毒。PM10染尘采用气管注入法，灌注1ml含15mg PM10生理盐水混悬液；染毒采用静态吸入SO2、NO2、CO空气混合气，浓度分别为15，12，400mg/m3,每天吸入2h，分别吸入1，7及30d；对照组大鼠气管注入1ml生理盐水并吸入正常空气。分别于染毒后1，7，30d进行支气管肺泡灌洗，观察灌洗液中白细胞总数及其分类；采用ELISA法测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞因子水平。结果   实验组大鼠BALF中，白细胞总数、中性粒细胞百分比明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜005或P＜001)。1d组大鼠BALF中，肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素8(IL8)及白细胞介素10(IL10)水平均明显高于对照组(P＜005)，各炎性细胞因子间有较好的相关性。结论   大气污染物可引起大鼠肺促炎细胞因子与抗炎细胞因子表达失衡，造成肺组织的炎性损伤。

　　关键词： 大气污染物；支气管肺泡灌洗液；细胞因子

　　Effects of air pollutants on pulmonary inflammatory cytokines in rats  

　　Abstract： Objective   To study the effects of air pollutants on pulmonary inflammatory cytokines in rats,and to explore the mechanism of air pollution on inflammatory injury of respiratory system.Methods   Fourty-eight Wistar rats (200～240g) were randomly divided into treated groups (1d,7d,and 30d groups) and control group.The tested rats were respectively exposed to PM10 of 15mg in 1ml saline by intratracheal instillation,and then were exposed to mixed gases of SO2,NO2,and CO (15,12,and 400mg/m3 respectively) by static inhalation 2h per day for 1d,7d and 30d respectively.One ml saline was instilled and general air was inhaled by rats of the control group.Results   The counts of white blood cell (WBC) and the percentages of neutrophil (Neu) in treated groups were significantly higher than those in the control group (P＜005 or P＜001).The levels of TNFα，IL6,IL8,and IL10 in rats of oneday group were significantly higher than those in the control group (P＜005).There were positive relationships among cytokines.Conclusion   Air pollutants can induce the imbalance on the expression of proand antiinflammatory cytokines and result in inflammatory injury of respiratory system.

　　Key words： air pollutants;bronchoalveolar lavage fluids (BALF);cytokines
     
　　大气污染直接作用的靶器官是呼吸系统，长期反复接触会使人体免疫力低下，引起气管炎、支气管哮喘等慢性疾病。目前有关大气污染对机体呼吸系统炎性损伤机制尚未完全明确。本文通过制备大气污染的动物模型，从大气污染对大鼠呼吸道微生态、氧化损伤及病改变等方面进行了研究〔1-4〕。本文通过测定大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素8(IL8)及白细胞介素4(IL4)、白细胞介素10(IL10)的水平，进一步探讨大气污染对大鼠呼吸系统炎性损伤的作用机制。结果报告如下。

　　1   材料与方法

　　11   材料  

　　111   可吸入颗粒物(PM10)制备   (1)样品采集：冬季采暖季节，选择煤烟、及生活污染区为采样点，用日本产低流量(20～30L/min)粉尘采样器和称重的55mm玻璃纤维滤膜，每天连续采样24h，连续采集30d;滤膜干燥后称重采尘量，含尘滤膜在-20℃下保存。(2)PM10悬浮液制备：将各采样点滤膜同时用一定量的生理盐水超声震荡洗脱20min，吸去滤膜水分，干燥后称重，计算生理盐水中粉尘量，定容后使其粉尘浓度为15g/L。

　　112   标准混合气制备   高于染毒浓度12倍的SO2、NO2、CO的空气标准混合气由具有国家标准物质资质认证的大连特种气体产业公司提供。染毒时将标准混合气减压，以流量计控制流速，稀释12倍后分别放入染毒柜内。

　　113   实验动物及分组   48只健康Wistar大鼠，体重200～240g，雌雄各半(医科大学实验动物中心)。随机分为3个实验组(1，7，30d组)和对照组，每组12只。

　　12   方法

　　121   染尘及染毒   (1)染尘：乙醚麻醉下气管注入染尘，实验组大鼠注入1ml含15mg PM10的生理盐水混悬液，对照组大鼠注入1ml生理盐水。(2)染毒：采用体积为60L染毒柜，每柜放入2只大鼠。实验组大鼠静态吸入浓度分别为15，12，400mg/m3的SO2、NO2、CO的空气混合气。每天吸入2h，各组分别吸入1，7及30d；对照组吸入正常空气。PM10、SO2、NO2及CO浓度均相当于国家《环境空气质量标准》(GB30951996)二级日标准的100倍。

　　122   采集大鼠样品   于染毒结束后次日处死大鼠，对照组大鼠分3批处死。乙醚麻醉下腹主动脉取血，分离血清；用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗(BAL)，每次2ml，洗3次，合并BALF，3000r/min离心10min。血清及BALF上清液置于-80℃低温冰箱保存。

　　123   检测指标及方法   BALF沉淀中白细胞(WBC)总数及分类［巨噬细胞(AM)、淋巴细胞(Lym)、中性粒细胞(Neu)］，采用常规计数及瑞氏染色法。BALF中TNFα、IL6、IL8、IL4及IL10水平采用双抗夹心ELISA法测定(美国R&D公司及晶美公司)；用CLINIBIO128型酶标仪(奥地利公司)测量吸光度(A)值。

　　13   统计分析   应用SPSS100软件拟合最佳的曲线回归方程，求出样品中各细胞因子浓度，进行单因素方差分析及相关分析。

　　2   结果

　　21   白细胞总数及分类(表1)   实验组大鼠BALF中WBC数及中性粒细胞百分比升高，与对照组比较差异均有统计学意义，尤以1d组明显(P＜001)；7及30d组WBC数及中性粒细胞百分比下降，与1d组比较差异有统计学意义(P＜001)。

　　表1   BALF中白细胞总数及分类（略）

　　注：与对照组比较，a P＜005,b P＜001;与1d组比较，c P＜005,d P＜001

　　22   促炎细胞因子水平(表2)   染毒1d组大鼠BALF中IL6、IL8及TNFα水平显著高于对照组；7及30d组水平下降，与1d组比较差异均有统计学意义。各因子中IL6表达水平最高，其次为TNFα。

　　表2   BALF中促炎细胞因子水平的比较（略）

　　注：与对照组比较，a P＜005,b P＜001;与1d组比较，c P＜005,d P＜001

　　23   抗炎细胞因子水平(表3)   实验组大鼠BALF中IL10水平显著高于对照组，尤以1d组明显；7及30d组水平有所下降，与对照组及1d组比较，差异有统计学意义，且IL10表达水平高于IL4。

　　表3   BALF中抗炎细胞因子水平的比较（略）

　　注：与对照组比较，a P＜005,b P＜001;与1d组比较，d P＜001

　　24   炎性损伤指标的相关分析   简单相关分析结果显示，10对炎性损伤指标均呈不同程度的正相关，相关系数(r)为0397～0785，均P＜005；偏相关分析结果显示，只有简单相关程度较高的前5对指标呈中等程度正相关(r=04552～06460)。

　　3   讨论

　　炎性细胞因子(Inflammatory cytokines,ICKs)是由各种免疫细胞和组织细胞分泌，具有调节炎性细胞功能及行为、影响炎性反应及转归的细胞活性物质，根据其对炎症反应的不同影响，可分为促炎因子和抗炎因子2类〔5〕。本文结果显示，实验组大鼠BALF中白细胞总数和中性粒细胞百分比均高于对照组，尤以1d组明显，提示大气污染物已引起大鼠呼吸系统明显的炎症反应。7及30d组白细胞总数和中性粒细胞百分比有所回落，但与对照组和1d组比较差异均有统计学意义，表明炎症正处于消退期，其结果反映了炎症生理过程的变化，与刘春涛等〔6〕报道的一致。本研究结果显示，1d组大鼠BALF中IL6、IL8、TNFα水平明显高于对照组，并且偏相关分析结果显示，TNFα与IL6(r=06217)及IL8与IL6(r=04552)分别呈中等程度正相关。说明在炎症早期IL6、IL8及TNFα之间存在着密切的联系。TNFα可能启动了IL6、IL8等细胞因子群，使其合成、分泌增多，诱导多形核白细胞(PMN)在肺组织聚集、粘附、并释放IL6和IL8等炎性介质〔7〕；而IL6可激活中性粒细胞、延迟吞噬细胞对衰老和丧失功能的中性粒细胞的吞噬，从而加剧了炎症介质的产生；IL8可诱导PMN趋化至炎症部位，脱颗粒，产生超氧离子，造成肺组织损伤〔8〕。本研究结果显示，IL4变化不明显，与对照组比较差异均无统计学意义，提示促炎细胞因子(TNFα和IL6)和抗炎细胞因子(IL4和IL10)的变化趋势不平行，处于一种失衡状态，这种局部失衡状态的炎症反应可能是造成组织炎性损伤的一个重要原因。本研究结果表明，大气混合污染物可诱导大鼠肺组织IL6、IL8、TNFα、IL4及IL10的释放，导致肺组织的炎性损伤。促炎因子中以IL6和TNFα表达水平较高，且与抗炎因子IL4及IL10呈较好的相关性；抗炎因子IL10表达水平高于IL4，因此，TNFα、IL6和IL10可作为大气污染所致肺早期炎症的敏感指标。

　　〔1〕   肖纯凌，王任群，席淑华，等.模拟大气污染对大鼠呼吸道微生态的影响［J］.公共卫生，2003，19(9)：1134-1135.

　　〔2〕   肖纯凌，席淑华，王任群，等.大气污染物对大鼠抗脂质过氧化能力的损伤［J］.环境与健康杂志，2003，20(5)：277-279.

　　〔3〕   肖纯凌，席淑华，王任群，等.大气污染对大鼠细胞因子的影响［J］.中国公共卫生，2003，19(7)：839-840.

　　〔4〕   肖纯凌，王任群，赵肃，等.大气污染对大鼠肺细胞毒性及病研究［J］.中国公共卫生，2004，20(10)：1200-1202.

　　〔5〕   RiffoVasquez Y,Spina D.Role of Cytokines and chemokines in bronchial hyperresponsiveness and airway inflammation［J］.Pharmacol Ther,2002,94(3):185-211.

　　〔6〕   刘春涛，王曾礼，冯玉麟，等.哮喘动物模型气道中白细胞介素5和10的动态变化及其意义［J］.中华结核和呼吸杂志，2000，23(4)：239-242.

　　〔7〕   尹文，梁继河，虎晓岷，等.山莨菪碱对创伤性肺损伤细胞因子及其mRNA表达的影响［J］.中华实验外科杂志，2000，17(1)：75-76.

　　〔8〕   Biffl WL,Moore EE,Moore FA,et al.Interleukin6 delays neutrophil apoptosis［J］.Arch Surge,1996,131(1):24-30.