内皮型一氧化氮合酶基因多态性与冠心病关系

【关键词】  ,冠心病；一氧化氮合酶,内皮；基因

　　摘要： 目的   探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因内含子4可变串联重复序列(VNTR)多态性与早发冠心病的关系。方法   以为基础的病例对照研究，选择新诊断的冠心病患者为研究对象。男性≤55岁及女性≤65岁患冠心病为早发冠心病，以188例早发冠心病患者为病例组，315例迟发冠心病患者为对照组。应用聚合酶链反应(PCR)技术检测eNOS基因内含子4 VNTR多态性。结果   eNOS基因内含子4 VNTR c/c、c/b、b/b、b/a、a/a基因型频率，早发冠心病组分别为053%，000%，8138%，1649%，160%；迟发冠心病组分别是 000%，032%，7746%，2032%，190%。c/c+c/b+b/b与b/a+a/a基因型在2组之间分布差异无统计学意义(P=0268，OR=1294，95%CI=0820～2043)。c、b、a等位基因频率，早发冠心病组分别是053%，8963%，984%；迟发冠心病组分别是016%，8778%，1206%。c+b与a的等位基因频率在2组间分布差异无统计学意义(P=0280，OR=1257，95%CI=0830～1904)。在α=005显著性水平上，用多元逐步非条件Logistic回归分析调整性别、吸烟、饮酒、收缩压、体质指数、腰臀比、甘油三酯和总胆固醇后，eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病也无显著相关(P=0427, OR=0819, 95%CI=0500～1341)。结论   eNOS基因内含子4 VNTR多态性可能不是早发冠心病发病的危险因素。

　　关键词： 冠心病；一氧化氮合酶，内皮；基因

　　Association between polymorphism of endothelial nitric oxide synthase gene and coronary heart disease  

　　Abstract： Objective   To assess the association between intron 4 VNTR polymorphism in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene and premature coronary heart disease(p-CHD).Methods   A hospital-based case-control study was conducted.Newly-diagnosed CHD patients were recruited as this study subjects.one hurdred and eighty-eight CHD patients diagnosed at/before 55 years old for males and 65 for females were assigned to p-CHD case group with other 315 CHD patients as the control group.Genotypes were detected by polymorphism chain reaction (PCR) technique.Results   The genotype frequencies of c/c,c/b,b/b,b/a,a/a were 053%,000%,8138%,1649%,160% in p-CHD group respectively and 000%,032%,7746%,2032%,190% in the control group respectively.There was no significant difference between the p-CHD and the control group for comparing genotype frequencies of c/c+c/b+b/b with b/a+a/a (P=0268,OR =1294,95%CI=0820～2043).The allele frequencies of c,b,a were 053%,8963%,984% in the p-CHD group respectively and 016%,8778%,1206% in the control group respectively.There was also no significant difference between the p-CHD and the control group for comparing allele frequencies of c+b with a (P=0280，OR=1257，95%CI=0830～1904).Stepwise multiple logistic regression analysis at 005 significant level with adjust ment of sex,smoking,alcohol drinking,systolic blood pressure,overweight,waist-hip ratio,serum triglyceride,serum total cholesterol covariates showed that the eNOS4a had no significant effect on p-CHD (P=0427,OR=0819,95%CI=0500～1341).Conclusion   eNOS intron 4 a/b VNTR polymorphism is not a risk factor for p-CHD.

　　Key words： coronary heart disease;nitric oxide synthase;endothelial;gene
     
　　遗传因素在冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病CHD)发病中具有重要作用，但早发与迟发病例在遗传背景方面存在较大差异，其中，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因对冠心病具有重要作用〔1〕。eNOS基因内含子4存在27bp的可变串联重复序列(VNTR)，研究显示，这种多态性与机体一氧化氮(NO)的代谢水平密切相关〔2〕。为探讨eNOS基因内含子4VNTR多态性与早发冠心病之间的关系，本文对188例早发冠心病及315例迟发冠心病进行观察比较。结果报告如下。

　　1   对象与方法

　　11   对象   选择2002年6月～2005年6月山东大学附属医院心内科确诊的新发病例503例，均符合1979年WHO制定的关于缺血性心脏病的诊断标准〔3〕，以男性≤55岁及女性≤65岁患有冠心病者为早发冠心病。以早发冠心病188例为观察组，平均年龄(511±776)岁；迟发冠心病315例为对照组，平均年龄(697±802)岁。

　　12   方法

　　121   现场调查   (1)问卷调查：内容包括年龄、性别、既往病史、吸烟史和饮酒史；体检包括身高、体重、腰围、臀围、收缩压(SBP)和舒张压(DBP)；并按体重/身高2(kg/m2)体质指数(BMI)，按腰围/臀围计算腰臀比(WHR)。(2)采集血样：抽取调查对象空腹肘静脉血5ml，其中1ml用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)-Na抗凝，用于基因组DNA提取；4ml分离血清，用于血清学检测。(3)血清生化指标检测：血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)用酶法测定，试剂盒由(北京中生生物工程高技术公司。)

　　122   基因组DNA提取   用十二烷基硫酸钠(SDS)及蛋白酶K消化，酚/氯仿提纯，乙醇沉淀。

　　123   eNOS基因内含子4 VNTR多态性检测   以提取的DNA为模板，根据设计的上、下游引物，用PCR方法特异性扩增含有可变串联重复序列的片段。引物序列，上游5′-CTCAGCCCAGTAGTGAAGAC-3′；下游5′-GCTTCTCTTAGTGCTGTGGT-3′。PCR反应体系总体积为30μl，其中含模板100ng，引物各03μmol/L，50mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH=84)，015mmol/L dNTPs，15U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。反应条件为95℃预变性5min，33个循环中95℃变性45s，58℃退火60s，72℃延伸45s，最后72℃延伸5min。PCR产物用8%的聚苯烯酰胺电泳，银染色观察实验结果。根据片段数量与长度进行基因型分析。

　　13   统计分析   用SPSS 115及STATA 82软件进行分析，计数资料用χ2检验；计量资料用两样本均数比较的t检验；多因素分析用多元逐步非条件Logistic回归。

　　2   结果

　　21   一般情况   (1)早发冠心病组男性104例，女性84例，性别比为124∶1；迟发冠心病组男性221例，女性94例，性别比为235∶1。早发冠心病组吸烟者73例，吸烟率为388%；迟发冠心病组吸烟者92例，吸烟率为292%。早发冠心病组饮酒者44例，饮酒率为234%；迟发冠心病组饮酒者45例，饮酒率为143%。其中性别比、吸烟率、饮酒率等差异均有统计学意义(P<005或P<001)。(2)2组检测指标比较：早发冠心病组收缩压/舒张压分别为(12747±1810)/(7922±1100)mmHg；迟发冠心病组为(13151±2339)/(7759±1284)mmHg。早发冠心病组体质指数为(2632±316)kg/m2，迟发冠心病组为(2496±369)kg/m2。早发冠心病组腰臀比为090±007，迟发冠心病组为088±007。早发冠心病组血清甘油三酯为(202±132)mmol/L，迟发冠心病组为(156±094)mmol/L。早发冠心病组胆固醇含量为(539±111)mmol/L，迟发冠心病组为(517±116)mmol/L。2组的收缩压、体质指数、腰臀比、血清甘油三酯和胆固醇含量等差异均有统计学意义(P<005或P<001)。

　　22   eNOS基因内含子4 VNTR基因型及等位基因频率分布(表1)   (1)将eNOS基因内含子4 的VNTR多态性按不同等位基因分析，4次串联重复序列等位基因记为eNOS4a；5次串联重复序列野生型等位基因记为eNOS4b；6次串联重复序列等位基因记为eNOS4c。PCR结果显示，共扩增出5种基因型，其中：a/a片段长度为425bp；b/a 2个片段长度分别为452和425bp；b/b片段长度为452bp；c/b 2个片段长度分别为479和452bp；c/c片段长度为479bp。(2)为观察eNOS4a基因型与冠心病的相关性，将eNOS4a与eNOS4b及eNOS4c进行基因型与等位基因频率分析。结果可见，c/c+c/b+b/b(合并后的频数与频率，早发冠心病组为154与8191%；迟发冠心病组为245与7778%)，与b/a+a/a(合并后的频数与频率，早发冠心病组为34与1809%；迟发冠心病组为70与2222%)，经比较，χ2=1229，P=0268，OR=1294，95%CI=0820～2043；c+b(合并后的频数与频率，早发冠心病组为339与9016%；迟发冠心病组为554与8794%)与a(频数与频率，早发冠心病组为37与984%；迟发冠心病组为76与1206%)，经比较，χ2=1167，P=0280，OR=1257，95%CI=0830～1904，差异均无统计学意义。

　　表1   eNOS基因内含子4 VNTR基因型及等位基因频率（略）

　　23   eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病关系多因素分析(表2)   在α＝005显著性水平上，用多元逐步非条件Logistic回归筛选性别、吸烟、饮酒、收缩压、BMI、WHR、甘油三酯、总胆固醇等有显著影响的可能混杂因素，并将eNOS基因内含子4 VNTR纳入模型，以探讨在控制可能的混杂因素后eNOS基因内含子4 VNTR多态性的效应。表2可见，eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病无显著性相关。

　　表2   eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病关系的多元Logistic回归分析（略）

　　注：VNTR：c/c+c/b+b/b与b/a+a/a比较；BMI≥240为1

　　3   讨论

　　目前，虽然国内外对eNOS4a/b VNTR多态性与冠心病之间的关系研究较多，但结果相差甚远。有资料认为〔4,5〕，eNOS4a 等位基因能显著升高冠心病的发病危险性。有研究表明〔6〕，eNOS4a/b VNTR多态性与冠心病无显著性相关，但有资料显示〔7〕，eNOS4a 等位基因对冠心病的发病具有显著的保护性作用。尽管导致现有资料结果相互矛盾的原因众多，但各研究所选研究对象年龄的不同可能是其原因之一，因为早发冠心病与迟发冠心病在遗传背景方面存在巨大差异。Lee等研究显示〔5〕，只有在年龄＜51岁的人群中，eNOS4a/b VNTR多态性与冠心病之间的关系才具有显著性。本研究结果显示，无论单因素分析还是多因素分析调整潜在的混杂因素后，eNOS4a/b VNTR多态性与早发冠心病之间均无显著性相关。唐欧杉等〔8〕选择年龄匹配的健康者作为对照组，结果显示，eNOS4a/b VNTR多态性与早发冠心病之间也无显著性相关，与本研究结果一致。关于eNOS4a/b VNTR多态性是否引起eNOS的功能改变目前尚无定论。虽然有资料显示〔2〕，eNOS4a 基因携带者血浆NO水平显著降低，但是eNOS4a等位基因与eNOS基因T-786C变异存在显著的连锁不平衡〔9〕，而eNOS基因T-786C变异能显著降低eNOS基因启动子活性〔10〕。因此，关于eNOS4a/b VNTR多态性仅仅是一个遗传标记，还是与冠心病发生相关的因素，以及其与冠心病之间的关系如何尚须进一步深入研究。

　　〔1〕   Kuhlencordt PJ,Gyurko R,Han F,et al.Accelerated atherosclerosis,aortic aneurysm formation,and ischemic heart disease in apolipoprotein E/endothelial nitric oxide synthase double knockout mice［J］.Circulation,2001,104:448-454.

　　〔2〕   Tsukada T,Yokoyama K,Arai T,et al.Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans［J］.Biochem Biophys Res Commun,1998,7,245:190-193.

　　〔3〕   第一届全国内术会议心血管病组.关于冠状动脉性心血管病命名及诊断标准的建议［J］.中华心血管病杂志,1981,9:75-77.

　　〔4〕   Matyar S,Attila G,Acarturk E,et al.eNOS gene intron 4 a/b VNTR polymorphism is a risk factor for coronary artery disease in Southern Turkey［J］.Clin Chim Acta,2005,354:153-158.

　　〔5〕   Lee WH,Hwang TH,Oh GT,et al.Genetic factors associated with endothelial dysfunction affect the early onset of coronary artery disease in Korean males［J］.Vasc Med,2001,6:103-108.

　　〔6〕   Milutinovic A,Hruskovicova H.The eNOS gene polymorphism does not have a major impact on lipid parameters and premature coronary artery disease in Slovene men (Caucasians)［J］.Folia Biol,2005,51:47-49.
　　
　　〔7〕   Park KW,You KH,Oh S,et al.Association of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene polymorphism with acute coronary syndrome in Koreans［J］.Heart,2004,90:282-285.

　　〔8〕   唐欧杉,徐耕,秦丰明,等.内皮型一氧化氮合酶基因多态性和早发冠心病的相关性研究［J］.岭南心血管病杂志,2004,10:293-296.

　　〔9〕   Yoshimura M,Yasue H,Nakayama M,et al.Genetic risk factors for coronary artery spasm:significance of endothelial nitric oxide synthase gene T-786>C and missense Glu298Asp variants［J］.J Invest Med,2000,48:367-374.

　　〔10〕   Cattaruzza M,Guzik TJ,Slodowski W,et al.Shear stress insensitivity of endothelial nitric oxide synthase expression as a genetic risk factor for coronary heart disease［J］.Circ Res,2004,95:841-847.