温度和pH的交互作用对黄绿青霉菌产毒影响
【关键词】 黄绿青霉菌；黄绿青霉素：产毒；交互作用
摘要： 目的 在实验室条件下观察温度、pH对黄绿青霉菌（PCV）产毒的影响及其交互作用。方法 采用析因实验设计，用察氏培养基培养黄绿青霉菌，二氯甲烷提取黄绿青霉素(CIT)，高效液相色谱法检测CIT毒素含量。结果 黄绿青霉菌在高温、低温、酸性及碱性条件下均可产毒，产毒量6030～33610μg／g培养基；高温、碱性条件下产毒量较高，是低温条件的2倍以上。结论 温度和pH对黄绿青霉菌产毒量有较大影响，且有交互作用。
关键词： 黄绿青霉菌；黄绿青霉素：产毒；交互作用
Interaction of temperature and pH on toxin production of penicillium citreoviridin
HOU Haifeng,QI Yongxiu,LI Qunwei.
Institute of Epidemiology,Taishan Medical College(Taian 271000,China)
Abstract： Objective Observe the effect of temperature,pH and their interaction on Penicillium citreoviridin's (P.C.V.) toxin production in laboratory.Methods P.C.V.was cultured in Charles culture medium in different conditions according to the factorial experiment for two factors.CIT was extracted by dichloromethane and quantitated by HPLC method.Results P.C.V.produced CIT in all Charles culture medium.Quantities of CIT produced by P.C.V.were 60.30～336.10μg/g medium.P.C.V.produced more CIT in warm condition in acid Charles culture medium.Conclusion Quantities of CIT produced by P.C.V.were affected by temperature,pH and their interaction.
Key words： penicillium citreoviridin(PCV)；citreoviridin(CIT)；production of toxin;interaction
黄绿青霉菌(Penicillium citreoviridin，PCV)属单轮青霉群，是污染粮食常见的真菌之一，尤其是在大米、小米霉变过程中经常可检出黄绿青霉菌，该菌污染的粮食外观呈黄绿色。黄绿青霉菌产生的黄绿青霉素(Citreoviridin，CIT)是一种具有心脏血管毒性、神经毒性、遗传毒性的真菌毒素〔1〕。相关研究表明，CIT是导致克山病的可疑病因〔2〕，并且温度、培养时间、酸碱度等黄绿青霉菌产毒条件与克山病病区环境条件十分类似〔3〕。为进一步探讨黄绿青霉菌产毒特征，本文对温度、pH对该菌产毒的交互作用进行观察。现将结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料 (1)菌株：黄绿青霉菌菌株(中科院微生物研究所)，菌株号为34033。(2)培养基：黄绿青霉菌培养采用察氏培养基，120℃高压灭菌20min。待温度降至60℃左右时，加入青霉素100U／ml，混匀。无菌条件下分装入培养皿，制成平板待用〔4〕。(3)标准溶液：CIT标准品(美国Sigma公司)分别用流动相配成1，2，5，10，40和100mg／L的标准溶液，冷藏待检。(4)仪器与试剂：Waters600液相色谱仪；Waters2996二极管阵列检测器，46mm×150mm,5μm Hypersil硅胶色谱柱(大连依利特公司)。
12 方法
121 培养条件控制 菌株培养在本所生物培养室进行，温度分别控制在30和8℃；通过高压灭菌前添加NaOH和HCl溶液，分别配制成pH50和90的培养基。采用2×2析因设计方法观察温度、pH对产毒的独立作用及交互作用；每种条件下培养5份，培养时间2周。
122 样品提取〔5，6〕 将培养物搅碎，移入具塞三角烧瓶，加入50ml二氯甲烷，塞紧磨沙塞，振荡10min，避光静置30min。过滤，取滤液2ml，在避光、通风条件下挥干，得到粗毒素，定容后上机检测。
123 分析条件〔5，6〕 采用高效液相色谱法检测标准溶液及样品中的CIT含量，流动相为乙酸乙酯：正己烷(7∶3，V／V)；流速为1ml／min；检测波长为383nm；分析时间10min。
13 统计分析 采用Waters Empower软件采集检测数据；采用SPSS 120软件进行统计分析。
2 结果
21 CIT含量与色谱峰面积关系标准曲线 以标准溶液浓度(mg／L)为自变量，色谱图峰面积(mV×s)为应变量，建立标准曲线方程：y=24400x+3020，相关系数(r)为099994，线性关系较好。
22 不同温度及pH条件下黄绿青霉菌产毒量 在高温、低温、酸性及碱性环境条件下黄绿青霉菌均可产生CIT毒素，产毒量分别为：高温酸性条件下（9214±1600)μg／g；高温碱性条件下(23476±7079)μg／g；低温酸性条件下(10170±557)μg／g；低温碱性条件下(9102±2670)μg／g。
23 析因设计方差分析结果(表1) 温度和pH影响黄绿青霉菌产毒，高温碱性条件下黄绿青霉菌产毒量高于低温酸性下产毒量(P<001)。温度和pH对黄绿青霉菌产毒的影响存在交互作用(P<001)。
表1 温度、pH对黄绿青霉菌产毒量影响析因设计方差分析结果（略）
3 讨论
本实验发现，温度和pH因素对黄绿青霉菌产毒的影响存在交互作用，黄绿青霉菌在高温碱性条件下比在酸性温下更易产毒，此结果与前期观察相同〔3〕。结果表明，黄绿青霉菌在高温(30℃)或变温(8～30℃)、弱碱性或中性条件下，只要有充足的营养，约10d左右即可产生大量CIT毒素。提示，克山病病区的地理特点是，病区的纬度与海拔高度呈相反关联特征，即高纬度的低海拔和低纬度的高海拔，这种海拔高度与纬度之间的配置关系表现为，病区内湿度较大；谷物收获期恰逢多雨天气；并且病区属大陆性气候，昼夜温差较大，在0～20℃之间波动〔7〕。克山病病区这种环境条件与本实验观察到的黄绿青霉菌产毒特性十分相似，提示在这种气温变化较大，环境酸碱度不稳定的条件下，黄绿青霉菌可以生长并产生大量毒素，一旦污染粮食，人畜食入该粮食后发生中毒，并引发克山病。本文结果为克山病与CIT关系的研究提供了实验室依据。
文献
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