微波辐照对大鼠海马COXI、IV基因表达影响

【关键词】  微波；海马；细胞色素C氧化酶；能量代谢

　　摘要：目的   研究微波辐照后大鼠海马组织细胞色素C氧化酶(COX)亚基I、IV mRNA表达变化和对酶活性的影响，探讨微波辐照对大鼠海马能量代谢影响的机制。方法   采用RT-PCR法检测微波辐照后海马组织COXI、IV mRNA水平，采用还原细胞色素C法和高效液相色谱法(HPIC)分别检测微波辐照后海马组织细胞色素C氧化酶活性和三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量。结果   微波辐照后，大鼠海马组织细胞色素C氧化酶活性和ATP含量明显降低，并与COXI、IV mRNA表达变化呈一致性。结论   微波辐照可影响大鼠海马COXI、IV mRNA表达而降低酶的活性，进而引起能量代谢障碍。

　　关键词： 微波；海马；细胞色素C氧化酶；能量代谢

　　Effect of microwave exposure on COXI and COXIV mRNA expression in hippocampus of rats  

　　Abstract： Objective   To study mRNA expression of cytochrome c oxidase (COX) subunit Ⅰ,Ⅳ and activity of cytochrome c oxidase in hippocampus of rats after microwave exposure,and to interpret the molecular mechanism of microwave exposure on the energy metabolism deficit in hippocampus of rats.Methods   The expression of cytochrome c oxidase subunit Ⅰ and Ⅳ mRNA after microwave exposure was detected by RT-PCR.The content of adenosine triphosphate(ATP),adenosine diphosphate(ADP),adenosine monophosphate(AMP) and activity of cytochrome c oxidase in hippocampus were detected by high performance liquid chromatography (HPLC) and reduced cytochrome c methods respectively.Results   Decreased activity of cytochrome c oxidase and content of ATP in hippocampus were found after exposure,cytochrome c oxidase subunit Ⅰ and Ⅳ mRNA was also downregulated.Conclusion   Microwave irradiation can decrease the expression of COXI,Ⅳ mRNA and avtivity of COX,and further to induce energy metabolism deficit in hippocampus of rats.

　　Key words： microwave;hippocampus;cytochrome c oxidase;energy metabolism
     
　　生活与微波技术的应用密切相关，由此导致的环境污染问题已引起了广泛关注。本研究选择在细胞色素C氧化酶(COX)活性中起主要作用的催化亚基Ⅰ和调节亚基Ⅳ为观察指标，观察微波对COX活性和基因表达的影响，以期探讨微波辐照致大鼠海马能量代谢改变的分子机制。

　　1   材料与方法

　　11   材料   (1) 实验动物：健康雄性Wistar大鼠(第三军医大学动物室)，体重180～220g。(2) 分组：随机分为对照组、微波辐照组。辐照组具体分为辐照后即刻，3，6，12h 4个观察组，对照组及辐照各组均为12只大鼠，共60只。(3) 仪器：PCR仪(美国MJ公司)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)；Du 640紫外分光光度计(德国Beckman公司)；高效液相色谱仪(日本岛津公司)。(4) 试剂：COXI引物(上游：5′GCTGCTAATACTGGCAGTGAGA3′，下游：5′GCTTCGGAAACTGACTTGTACC3′，扩增片段约381 bp)；COXIV引物(上游：5′GGCAGCAGTGGCAGAATGTTGG3′,下游：5′ACAAGCGCAGTGAAGCCGATGA3′,扩增片段约364bp)；内参βactin(上游：5′TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3′,下游：5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3′，扩增片段约241bp)，所有引物由上海Sangon公司合成。ATPNa2、ADPNa2、Cytc(美国Sigma公司)。

　　12   方法

　　121   动物辐照   动物置于可透谢微波的专用辐照盒内，在反射近似零的辐照暗室接受全身一次性辐照20min，辐照环境温度和湿度用设备保持恒定，温度(18±2)℃，湿度50%～70%，对照组除不接受辐照原的作用外其他处理条件与辐照组一样。

　　1.2.2   海马组织腺嘌呤核苷酸测定［1］   将大鼠断头处死，冰浴条件下分离海马，准确称重，按20μl/mg组织加入预冷的02mol/L高氰酸匀浆，4℃，18000g离心15min，上清液用1mol/L碳酸钾中和并调pH至65～70，重复离心1次，取上清液作高效液相色谱分析，采用公式EC(energy charge,EC)=(ATP+05ADP)/(ATP+ADP+AMP)能荷。

　　123   海马组织COX活性测定［2］   冰浴条件分离海马，将一侧海马准确称重，按100mg/ml加入10mmol/L预冷的磷酸钠缓冲液匀浆备用。取还原纯化好的015mmol/L细胞色素C05ml,加入10mmol/L磷酸钠缓冲液24ml摇匀，在37℃，波长550nm测吸光度(A)值，然后加入01ml组织匀浆液，立即开始记时，随后每隔30s测定1次，最后加入饱和铁氰化钾1滴测A值，以最小二乘法计算经原点求其斜率k值，即为细胞色素C氧化速率常数，代表细胞色素C氧化酶活性。

　　124   RT-PCR检测大鼠海马COXI、COXIV mRNA表达   各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(30mg/kg)麻醉，取海马，提取RNA，进行RT-PCR测定。COXI循环参数。95℃ 30s,56℃30s,72℃ 1min,循环31次，72℃ 5min;COXIV循环参数：95℃ 30s,61℃ 30s,72℃ 1min，循环40次，72℃ 5min；β-actin循环参数：95℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 1min，循环31次，72℃5min；PCR产物行15%琼脂糖凝胶电泳。

　　125   图像分析   将电泳凝胶置于Gel Doc 2000凝胶图像分析系统，扫描测得PCR电泳条带的吸光度值，结果以各检测基因与自身β-actin条带吸光度比值表示。

 
　　13   统计分析   采用SPSS 100软件进行t检验。

　　2   结果

　　21   微波辐照对能量代谢的影响(表1)   大鼠海马组织ATP含量在微波辐照后即刻，3，6，12h与对照组相比分别下降85%(P＜005),223%(P＜001)，227%(P＜0.01)，334%(P＜001)。微波辐照后各时相点海马组织能荷(EC)显著低于对照组。海马组织ADP含量在辐照后12h升高(P＜005)。

　　表1   微波辐照后不同时相点海马组织高能磷酸盐的含量（略）

　　注：与对照组比较，*P＜005,**P＜001

　　22   微波辐照后细胞色素C氧化酶活性变化(表2)   微波辐照后即刻，3，6，12h海马组织COX活性显著下降(P＜001)，分别为对照组的734%，625%，609%，453%。

　　表2   微波辐照后不同时相点海马组织COX活性变化（略）

　　注：与对照组比较，**P＜001；k为细胞素C氧化速率常数

　　23   微波辐照对COXI mRNA表达的影响(图1)   COXI RT-PCR扩增产物电泳结果显示，扩增片段长度为381bp，与预期的目的片段相同。大鼠海马组织COXI mRNA表达在微波辐照后即刻，3，6,12h逐渐下降并明显低于对照组(P＜001)，其在辐照后即刻，3,6,12h分别为对照组的872%，762%,781%,720%。

　　C:对照；M:marker

　　图1   微波辐照后COXI mRNA表达变化(RT-PCR)（略）

　　24   微波辐照对COXIV mRNA表达的影响(图2)   COXIV RT-PCR扩增产物电泳结果显示，扩增片段长度为364bp，与预期的目的片段相同。大鼠海马组织COXIV mRNA表达在微波辐照后3h开始下降(P＜005)，在6，12h明显下降(P＜001)，其在辐照后即刻，3，6，12h分别为对照组的926%，884%，876%，868%。

　　C:对照；M:marker

　　图2   微波辐照后COXIV mRNA表达变化(RT-PCR)（略）

　　3   讨论

　　本实验表明，微波辐照使大鼠海马组织COX活性下降并可导致严重的能量代谢障碍，提示微波可影响线粒体的功能。COX是线粒体呼吸链传递的终末复合酶，是线粒体氧化能力的关键调节部位［3］。哺乳动物COX由13个亚基组成，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ大亚基由线粒体基因组编码，具有酶的催化活性［4］。其余10个小亚基由细胞核基因组编码，对酶的活性具有调节作用。在稳定状态下，两基因组编码的亚基在转录、翻译及调节水平具有协同表达效应［5，6］。本实验结果表明，海马组织COXI mRNA表达在辐照后各时相点明显下降，COXIV mRNA表达在照后3h开始下降，在辐照后6，12 h明显下降，提示微波对线粒体基因组和核基因组编码亚基在转录水平上可能具有协同损伤效应，微波辐照后COXI和COXIV mRNA表达变化和COX活性变化相一致，与ATP变化相吻合。结果表明，微波辐照可通过对线粒体基因组和核基因组编码亚基在基因转录水平上的损伤影响酶亚基的表达，导致酶的活性下降，最终引起能量代谢障碍。

　　

　　〔1〕   邓锋，刘昭荣，吴小红，等.高压液相色谱检测低氧对大鼠脑组织中腺苷酸含量［J］.解放军预防医学杂志，1996，3：185-188.

　　〔2〕   Ostermeier C,Iwata S,Michel H.Cytochrome c oxidase［J］.Curr Opin Struct Biol,1996,6(4):460-466.

　　〔3〕   魏相德，王家凤.氰化钠对大鼠不同脑区细胞色素氧化酶活性的影响［J］.第三军医大学学报，1992,14(3)：293-295.

　　〔4〕   Y Kamei,L Xu,T Heinzel,et al.A CBP integrator complex mediates transcriptional activation and AP-1 inhibition by nuclear receptors［J］.Cell,1996,85:403-414.

　　〔5〕   Anthong G,Reimann A,Kadenbach B,et al.Tissue-specific regulation of bovine heart cytochrome c oxidase activity by ADP via interaction with subunit VIa［J］.Proc Natl Acad Sci,1993,90(5):1652-1656.

　　〔6〕   Conner M K,Hood D A.Effect of microgravity on the expression of mitochondria enzymes in rat cardiac and skeletal muscles［J］.J Apple physiol,1998,84(2):593-598.