赛莱西布对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡影响
【关键词】 ,HepG2细胞;环氧合酶-2；赛莱西布；增殖;凋亡
摘要： 目的 探讨选择性环氧合酶-2(cox-2)抑制剂赛莱西布(celecoxib)对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法 用不同浓度的赛来西布处理HepG2细胞，分别应用四甲基偶氮噻唑蓝试验、DNA梯度电泳法、放射免疫法检测赛亚西布对HepG2细胞增殖和凋亡及其cox-2活性的影响；应用免疫印迹法和比色法检测赛莱西布对HepG2细胞胱氨酸蛋白酶3(clasepase-3)蛋白质的表达及活性的影响。结果 125，25，50μmol/L的赛莱西布作用于HepG2细胞后，HepG2细胞增殖受抑制，与对照组比较，差异有统计学意义(P<001)；赛莱西布干预组HepG2细胞DNA明显降解，可见细胞凋亡特征性梯状DNA条带；干预组HepG2细胞caspase3蛋白表达及活性均明显升高，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<001)；赛莱西布明显抑制HepG2细胞cox-2活性，与对照组比较，差异有统计学意义(P<001)。结论 赛莱西布可通过cox-2通路和caspase3通路抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡。
关键词： HepG2细胞;环氧合酶-2；赛莱西布；增殖;凋亡
Effects of cyclooxygenase-2 on proliferation and apoptosis in HepG2 cells
Abstract： Objective To examine the effects of a selective inhibitor of cox-2,celecoxib on growth and apoptosis in HepG2 cells.Methods HepG2 cells were treated with various concentrations of celecoxib.Cell growth was measured by MTT,apoptosis was detected by DNA fragmentation assay,and cox-2 activity was measured by RIA;Expression of caspase-3 protein in HepG2 cells was determined by western blot,and caspase-3 activity was measured using colorimetric assay.Results After HepG2 cells were treated with different concentrations of celecoxib (12.5,25,50μmol/L),celecoxib could significantly suppress the growth of HepG2 cells respectively compared with the control group (P<0.01),and celecoxib-treated HepG2 cells produced a distinct oligosomal ladder,the characteristics of cells undergoing apoptosis;Meanwhile,The caspas-3 expression and activity of celecoxib treated HepG2 cells were increased respectively as compared with the control groups(P<0.01).Furthermore,the level of cox-2 activity was reduced in celecoxib-treated HepG2 cells respectively compared with the control group (P<0.01).Conclusion Celecoxib could inhibit the proliferation and increase apoptosis in HepG2 cells by cox-2 and caspase3 pathways.
Key words： HepG2 cell;cyclooxygenase-2;celeeoxib;proliferation;apoptosis
近年来的研究表明，环氧合酶-2(cox-2)在结直肠癌、食管癌、肺癌等多种人类肿瘤组织中高表达〔1-3〕。最新报道显示〔4，5〕，cox-2在肝癌组织中也高表达，并且在肝硬化组织中过表达，提示cox-2可能是肿瘤防治的一个新靶点〔3〕。非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)具有预防和辅助肿瘤尤其胃肠道肿瘤的作用〔6〕，但NSAIDs抑制肿瘤的作用机制尚不明确。本研究选择NSAIDs类药物中的1种高选择性cox-2抑制剂赛莱西布(赛来西布)，作用于人肝癌细胞株HepG2观察其对HepG2细胞增殖与凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料
111 试剂 赛莱西布(celecoxib，美国Cayman公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT，上海华美生物工程公司)；二硫代苏糖醇(DTT，美国Promega公司)；兔抗aspase-3抗体、兔抗人cox-2多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；底物Ac-DEVD-pNa(N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilide)、核糖核酸酶-A(RNaseA)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(Hepes)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂(aprotinin，美国Sigma公司)，RMPI-1640培养基、小牛血清美国Gibco公司)；PGE2放射免疫测定试剂盒(苏州大学医学院)。
112 仪器 5415R低温台式高速离心机(德国Eppendorf公司)；HVE50凝胶成像系统(美国SYNGENE公司)；GS-930薄层扫描图像分析仪(日本岛津公司)；2123TC型CO2培养箱(美国Sheldon公司)；ELX800酶标仪(美国Bio-Tek公司)。
12 方法
121 细胞培养 人肝肿瘤细胞株HepG2由广西医科大学实验中心保存。HepG2细胞为贴壁细胞，用含10%小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基在37℃、饱和湿度及5%CO2的细胞培养箱内传代培养。
122 MTT法测定赛莱西布对HepG2细胞增殖的影响 用25g/L胰蛋白酶消化对数生长期的HepG2细胞制备单细胞悬液。以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板，24h后换液，加入不同浓度赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/L。设不进行药物干预的细胞为对照组。每种浓度平行4个复孔，继续培养。MTT法〔7〕测定赛莱西布对HepG2细胞增殖的影响。
123 DNA梯度电泳法检测HepG2细胞凋亡DNA片断 将1×106个细胞接种于100ml培养瓶，细胞贴壁后换液，加入赛莱西布使其终浓度分别为125，50μmol/L。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养48h，提取细胞基因组DNA，应用DNA梯度电泳法〔7〕检测HepG2细胞凋亡DNA片断。电泳结果用HVE50凝胶成像系统观察、分析、拍照。
124 放射免疫法检测HepG2细胞cox-2活性 前列腺素E2(PGE2)是cox-2催化花生四烯酸产生前列腺素的主要产物，可用细胞分泌PGE2的水平来反映cox-2的活性。因此，可采用赛莱西布对HepG2细胞分泌PGE2的能力的影响来反它对cox-2活性的影响：以1×106/孔的密度将HepG2细胞接种于24孔板，24h后换培养基，设不进行药物干预的细胞为对照组，125，25，50μmol/L浓度的赛莱西布为干预组，每种浓度平行4复孔，继续培养24h后收集上清。按PGE2放射免疫试剂盒说明测定PGE2。
125 HepG2细胞caspase-3活性的测定 以1×106个细胞接种于100ml培养瓶，细胞贴壁后换液，加入赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/L。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养24h后，收集漂浮和贴壁的细胞，并加入预冷的细胞裂解液［50mmol/L的Tris-Cl,200mmol/L的NaCl，2mmol/L的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，1%(V/V)Triton X-100、01mmol/L的PMSF］，冰上孵育10min后，以15000r/min离心5min(4℃)，取上清，并对其蛋白定量〔8〕。以细胞裂解液将待测样品蛋白浓度稀释至4g/L。反应体系含40μl待测样品、10μl的显色底物Ac-DEVD-pNa(20μmol/L)、50μl 2×反应缓冲液［100mmol/L的Hepes、2%(V/V)甘油、5mmol/L的DTT、05mmol/L的EDTA］，37℃水浴中避光孵育2h以上，以EL×800酶标仪在450nm波长处测定样品A值，以不加底物样本作空白比色。caspase-3活性直接以A值表示。同时在赛莱西布作用细胞前2h预加入Ac-DEVD-CHO，2h后再加入赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/l，以下处理和检测同上。
126 Western blot检测HepG2细胞caspase-3蛋白质表达 将1×106个细胞接种于100ml培养瓶，细胞贴壁后换液，加入不同浓度赛莱西布使其终浓度分别为125，25，50μmol/L。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养48h后，用预冷的磷酸盐缓冲度(PBS)漂洗细胞，加入100μl预冷的细胞裂解液［50mmol/L的Tris-Cl,200mmol/L的NaCl，2mmol/L的EDTA，1%(V/V)的Triton X-100、01mmol/L的PMSF］，于冰上孵育20min后，15000r/min4℃离心5min，提取蛋白，并测定蛋白含量〔8〕。以细胞裂解液将待测样品蛋白浓度稀释至4g/L。蛋白印迹(Western blot)法〔8〕检测HepG2细胞caspase-3蛋白质表达。用DAB显色试剂盒显色，检测杂交信号，岛津CS-930薄层扫描图像分析仪蛋白条带的积分A值。
13 统计分析 应用SPSS100软件进行t检验。
2 结果
21 赛莱西布对HepG2细胞增殖的影响 不同浓度赛莱西布作用于HepG2细胞72h后，125，25和50μmol/L干预组的A值分别为139±016，099±012，058±011，均显著低于与对照组A值243±026，差异有统计学意义(P<0001)。表明赛莱西布对HepG2细胞增殖有明显抑制作用，随着药物浓度增大，赛莱西布对HepG2细胞的增殖抑制作用更加明显。
22 赛莱西布对HepG2细胞凋亡的影响(图1) 图1可见，对照组HepG2细胞DNA电泳主要表现为靠近加样孔附近完整的基因组DNA，而赛莱西布干预组HepG2细胞DNA明显降解，可见细胞凋亡的特征性梯状DNA条带。
1：25μmol/L；2：空白对照；3：50μmol/L
图1 不同浓度赛莱西布干预处理48h对HepG2细胞凋亡影响（略）
23 赛莱西布对HepG2细胞caspase-3蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，不同浓度的赛莱西布干预处理HepG2细胞48h，干预组HepG2细胞的capase-3的蛋白表达均明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<001，图2，表1)。
1：空白对照；2：12.5μmol/L；3：25μmol/L;4：50μmol/L
图2 赛莱西布对HepG2细胞caspase-3蛋白表达水平影响（略）
表1 赛莱西布对HepG2细胞caspase-3蛋白表达水平的影响（略）
24 赛莱西布对HepG2细胞caspase-3活性的影响 125，25和50μmol/L干预组caspase-3活性分别为024±0013，044±0016，071±009，均高于与对照组caspase-3活性001±0012，差异有统计学意义(P<0001)，表明赛莱西布可诱导HepG2细胞caspase-3活性的升高。进一步用caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO先于赛莱西布与细胞作用，2h后再加入赛莱西布作用24h，发现赛莱西布中Ac-DEVD-CHD处理组HepG2细胞caspase-3活性显著低于赛莱西布组，表明Ac-DEVD-CHO能抑制赛莱西布诱导HepG2细胞的凋亡。
25 赛莱西布对HepG2细胞cox-2活性的影响 125，25和50μmol/L干预组前列腺素E2(PGE2)水平(pg/(ml・106 cells)分别为3610±435，2627±366和1765±273，均显著低于与对照组11228±871，差异有统计学意义(P<0001)，表明赛莱西布可明显抑制HePG2细胞PGE2释放水平。随着药物浓度的增加，PGE2释放水平逐渐下降，表明赛莱西布可抑制HepG2细胞cox-2活性。
3 讨论
本研究发现，用不同浓度赛莱西布作用于HepG2细胞后，对细胞生长增殖有明显抑制作用，并且随着浓度的增大，这种抑制作用更明显，呈一定的剂量依赖关系。用DNA梯度凝胶电泳法观察赛莱西布对HepG2细胞凋亡的影响，发现赛莱西布干预组的细胞基因组DNA电泳表现为特征性的梯形条带，说明cox-2参与了HepG2细胞凋亡过程。放射免疫法检测显示，HepG2细胞培养上清中有PGE2的释放，赛莱西布可明显抑制HepG2细胞PGE2释放水平，减少PGE2产生。而PGE2是cox-2催化花生四烯酸产生PGs的主要产物，说明赛莱西布可能通过抑制cox-2酶催化活性而减少PGE2产生，从而抑制HepG2细胞增殖，诱导其凋亡。本研究发现，赛莱西布以剂量依赖性方式诱导HepG2细胞caspase-3蛋白表达水平显著增加，其活性也明显升高，提示caspase-3活化介导了赛莱西布诱导的HepG2细胞凋亡。为进一步证实上述结论的可靠性，本研究用caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO预先作用于HepG2细胞，再施以赛莱西布干预。结果显示，当封闭caspase-3的裂解激活，相同浓度赛莱西布诱导的HepG2细胞凋亡明显受到抑制。提示赛莱西布可通过激活caspase-3而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究结果显示，赛莱西布可通过cox-2通路和caspase-3通路抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡。最近，Ferrandina〔9〕等对14例患有头颈部癌的病人给予短时期的赛莱西布处理后，病人平均cox-2表达水平显著降低，Ki67明显下降，肿瘤组织微血管密度值明显降低。结合本研究结果，提示选择性cox-2抑制剂是一种有应用前景的肝癌预防和的化学药物。
〔1〕 Zha S,Yegnasubramaniav V,Nelson WG,et al.Cyclooxygenases in cancer,progress and perspective［J］.Cancer Lett,2004,215(1):1-20.
〔2〕 Yu HP,Xu SQ,Liu L,et al.Cyclooxygenoase-2 expression in squamous dysplasia and squamous cell carcincma of the esophagus［J］.Cancer Lett,2003,198(2):193-201.
〔3〕 高雪芹，张维东.COX-2在肿瘤组织的表达及其化学预防靶点的意义［J］.公共卫生，2002，18(2)：249.
〔4〕 Sung YK,Hwang SY,Kim JO,et al.The correlation between cyclooxygenase-2 expression and hepatocellular carcinongenesis［J］.Mol Cells,2004,29,17(1):35-38.
〔5〕 Chi-Man Tang T,Tung-Ping Poon R,et al.The significance of cyclooxygenase-2 expression in human hepatocellular carcinoma［J］.Biomed Pharmacother,2005,59(Suppl):311-316.
〔6〕 Elder Dj,Halton DE,Crew TE,et al.Apoptosis induction and cyclooxvgenase-2 regulation in human colorectal adenoma and carcinoma cell lines by the cyclooxygenase-2 selective non-steroidal anti-inflammatory drugs NS-398［J］.Int J Cancer,2000,86(4):553-560.
〔7〕 刘斌.细胞培养中的研究方法［M］//司徒镇强，吴军正.细胞培养.2版.西安：世界图书出版西安公司，2004：250-280.
〔8〕 薛辉.western blot［M］//司徒镇强，吴军正.细胞培养.2版.西安：世界图书出版西安公司，2004：346-352.
〔9〕 Ferrandina G,Ranelletti FO,Legge F,et al.Celecoxib modulates the expression of cyclooxygenase-2,ki67,apoptosis-related marker,and microvessel density in human cervical cancer:a pilot study［J］.Clin Cancer Res,2003,9(12):4324-4331.
