VEGF, b

【关键词】  胎血；内皮祖细胞；诱导

　　VEGF and bFGF induced differentiation of mononuclear cells from human umbilical cord blood into endothelial progenitor cells in vitro

　　【Abstract】  AIM:  To research a way for mononuclear cells from human umbilical cord blood in vitro to be differentiated into endothelial progenitor cells under the induction of VEGF and bFGF.  METHODS:  The mononuclear cells were obtained from human umbilical cord blood by Ficoll densitygradient centrifugation. The cells were suspended in medium 199(M199) supplemented with VEGF, bFGF for culture, differentiation, proliferation and identification. The expressions of specific antigens on cell surface were analyzed by immunohistochemistry and  immunofluorescence. RESULTS:  The mononuclear cells from human peripheral blood which were cultured and induced in vitro by VEGF and bFGF were positive for KDR, CD1133 and CD34. CONCLUSION:   Mononuclear cells from human umbilical cord blood can be induced to differentiate into endothelial progenitor cells in vitro under certain condition.

　　【Keywords】  fetal  blood; endothelial progenitor cells; induction

　　【摘要】 目的： 研究VEGF, bFGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化. 方法： 从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞，在加有VEGF，bFGF的M199培养基中培养，培养7 d，免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达. 结果： 人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, bFGF的诱导分化，表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34. 结论： 人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞.
 
　　【关键词】 胎血；内皮祖细胞；诱导

　　0引言
　　
　　内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞［1］. 研究发现, EPC不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程,因此, EPCs在冠心病、肿瘤、创伤愈合等疾病具有广阔的临床应用前景. 今年来，EPCs在基础研究、心血管疾病、肢体缺血性疾病等领域的研究十分活跃，国外关于EPCs的研究初步深入，而在国内EPCs的研究尚处于起步阶段. 我们从人脐血中分离培养、体外扩增并观察EPCs的体外分化过程，为EPCs的进一步研究打下基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料比重1.077±0.001的聚蔗糖泛影葡胺（商品名为淋巴细胞分离液）. DHanks液（无Ca2+, Mg2+）. VEGF, bFGF为Sigma公司. 胎牛血清（杭州四季青公司）. 鼠抗人CD34单克隆抗体，兔抗人KDR单克隆抗体，FITC标记羊抗鼠、羊抗兔二抗，鼠抗人CD133单克隆抗体(Santa Cruz公司). M199培养液，免疫组化染色试剂盒（即用型SABC）（武汉博士德生物工程公司）. 美国Santa Cruz Bio公司荧光显微镜；OlympusCK40型倒置显微镜；低温高速离心机Biofuge22R型.
 
　　1.2方法
  
　　1.2.1EPCs的采集和分离人脐带血均取自足月健康的产妇，每份采血约40~60 mL，复方枸橼酸钠注射液（ACDA）按1∶10加入抗凝. 然后1∶1加入PBS稀释，EPCs的分离采用Ficoll密度梯度离心法. 2000 r/min, 20 min离心后管内分为三层，取上、中层界面处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带置入另一离心管中，以Hanks液离心洗涤细胞两次. 末次离心后，弃上清，以Ｍ199培养液（含有100 mL/L胎牛血清，细胞生长因子VEGF和bFGF）重悬细胞. 取一滴细胞悬液与一滴2 g/L台酚兰染色液混合，单个核细胞的浓度及细胞活力的检测.
 
　　1.2.2EPCs的培养单个核细胞以5×108/L的密度接种于铺有10 g/L明胶的培养瓶中，放入37℃,  50 mL/L CO2，湿度100%的细胞培养箱培养，48 h后弃去贴壁细胞，悬浮细胞离心后用M199培养液重悬，以2×108/L 的密度接种于放有盖玻片的六孔板中. 每3 d换液，用Hanks液洗掉未贴附的细胞. 在培养的第7日收集爬片细胞,进行鉴定.

 
　　1.2.3免疫荧光检测取培养第7日的爬片细胞，40 g/L多聚甲醛固定20 min，再用PBS洗3次，每次5 min，干燥后加入FITC直标鼠抗人CD133单克隆抗体100 μL (1∶50倍稀释)，放入湿盒内３７℃保温1 h，同时以PBS替代CD133单抗作阴性对照. 然后用PBS洗２次，蒸馏水洗一次，封片，荧光显微镜下观察.
 
　　1.2.4免疫组织化学检测爬片细胞在培养第7天用40 g/L多聚甲醛固定20 min,内源性过氧化物酶用30 ml/L H2O2灭活,非特异性结合用30 ml/L BSA阻断,抗体为兔抗人KDR、鼠抗人CD34. 4℃过夜, SABC法显色,苏木素复染,脱水、封片，倒置显微镜下观察结果.

　　2结果

　　从新鲜脐血中得到的单个核细胞呈圆形，苔盼蓝染色显示细胞存活率为99%. 被分离的脐血单个核细胞在培养48 h后出现贴壁，在4～5 d时生长最快，大约在培养5 d出现大量的梭形细胞. 单个核细胞培养5 d后，镜下可见大量的细胞团形成. 大约在培养6 d，可见长梭形细胞以细胞团为中心呈放射状生长. 同时，也可见散在的长梭形细胞. 培养7 d，可见由多个长梭形细胞首尾相连形成条带样排列，有时还可见到两排细胞平行排列呈管样结构（图1）. 进行KDR, CD133和CD 34等表面标记物的免疫荧光及免疫组化检测，免疫组化显示CD34, KDR呈阳性染色. 免疫荧光显示细胞CD133阳性染色，荧光显微镜下细胞膜和胞浆中可见黄绿色荧光（图2）.

　　A：细胞团（5 d）； B：长梭形细胞形成条带样（7 d）×200.

　　图1外周单个核细胞培养图2免疫荧光检测CD133阳性染色（7 d）×400（略）

　　3讨论

　　Ashara等［3］1997年从外周血中分离培养出EPCs，并且证明EPCs也参与了出生后的血管生成. 这一发现为缺血性疾病提供了一种全新的方案，可以通过动员、体外扩增、移植EPCs来促进新生血管的形成. 本实验拟在建立一种较为简便可靠的方法来获取EPCs，为EPCs的临床应用做准备.
   
　　目前体外分离EPCs的方法有多种，主要有密度梯度离心法和免疫磁珠分选法. 也有部分学者将2种方法结合起来，先离心后再用免疫磁珠分离分选. 密度梯度离心法操作简便、使用方便，但存在分离不纯，只能将血中整个单核细胞（包括EPCs）分离出来，还包括部分的血小板. 而免疫磁珠分选法一般早期采用CD34抗体，近年越来越多的学者采用CD133抗体，此方法最大的优点是可以收集到较高纯度的EPCs，但许多学者发现，分离的CD34＋或CD133＋细胞数非常少，单独培养时往往不增殖，只能在和CD34-或成熟内皮细胞共同培养时才有增殖活性［2］. 而且免疫磁珠分选法存在操作复杂和费用较高的缺点，故难以推广.      CD34被一些研究者作为分离内皮祖细胞的特异性标记［4］. CD34在早期造血干细胞中高表达，随造血细胞成熟表达下降，但它在血管内皮细胞中也表达. 因而用CD34分离的循环内皮细胞难以区分是血管壁脱落的成熟内皮细胞，还是内皮祖细胞.近年来报道CD133是一种五次跨膜细胞表面分子(Mr 120 000)，是一种早期抗原，它选择性地在骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表达［5］，但在成熟内皮细胞上不表达［4］. 因此，采用CD133分选可排除血管壁脱落的成熟内皮细胞.

　　胚胎发育过程中，各器官组织中均存有血管内皮细胞，随着各器官功能分化，血管内皮细胞发育为器官特异性内皮细胞，但内皮细胞亦具有共同的抗原. 为了确定贴壁梭形细胞是内皮细胞，我们采用内皮细胞特异性标志KDR, CD133, CD34来鉴定. 结果发现，贴壁的梭形细胞不同程度地表达这些特异性标志，这说明培养出的梭形细胞为内皮细胞.
 　　
　　脐血作为一种干细胞资源，具有取材无创伤，资源丰富，富含早期干细胞等诸多优点. 脐血中造血干祖细胞的数目要明显高于同等量的外周血，作为造血干细胞的来源之一，有人估计骨髓、脐血、成人外周血中CD34＋细胞比为3∶2∶0.2. 我们从脐血中分离CD133细胞成功诱导分化成内皮细胞，提示脐血中存在内皮祖细胞，它可以作为产生内皮细胞的来源但是，每份脐血所含内皮祖细胞有限，因此，为了满足治疗性血管重建要求，需进一步探索适宜的生长因子组合及时间条件，使其能稳定的进行体外扩增，从而使内皮祖细胞治疗缺血性疾病更接近临床.

　　【】

　　［1］  Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, et al. Expression of VEGF2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］. Blood,2000,95（3）:952-958.

　　［2］  Murohara T, Ikeda H, Duan J, et al. Transplanted cord blood derived endothelial precursor cells argument postnatal neovascularization［J］. J Chin Invest, 2000,105:1527-1536.

　　［3］  Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis［J］. Science, 1997,14;275(5302):965-967.

　　［4］  Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, et al. Expression of VEGF2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］. Blood, 2000,95（3）:952-958.

　　［5］  Yin A, Miraglia S, Zarjani E, Porada G, et al. AC133, a novel marker for human hematopoie stem and progenitor cells［J］. Blood, 1997,90:5002-5012.