p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的相关性
【关键词】 ,基因,p53；基因,p16；癌,肝细胞
Correlation of p53 gene mutation and p16 gene deletion with hepatocellular carcinoma
【Abstract】AIM: To detect the probability of p53 gene mutation and p16 gene deletion in the plasma of the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and to explore its correlation with onset and development of HCC and its clinical significance. METHODS: PCR was used to amplify p53 gene exon 58 and the immunohistochemistry (SPp16) was employed to determine the deletion of p16 gene. The difference between the patients with or without liver metastasis was analysed in gene mutation and deletion. RESULTS: Of 33 cases of HLL 17(51.55%), showed the mutation of p53; the mutation rate in metastasis group(n=18) was higher than that in nonmetastasis group(n=15). CONCLUSION: There is a correlation between HCC and p53 gene mutation and p16 gene deletion .The mutation rate may have the reference value in diagnosis and prognosis prediction of HCC.
【Keywords】 genes p53; genes p16; carcinoma, hepatocelluar
【摘要】 目的： 检测肝癌患者血浆中p53基因突变和细胞核中p16基因缺失的机率，研究与疾病发生、的相关性并探讨其意义. 方法： 实验采用聚合酶联链式反应（PCR）扩增p53基因外显子5~8和免疫组织化学方法SPp16，对其突变和缺失进行分析. 结合临床患者有无肝组织以外转移来对比差异性. 结果： 33例肝癌患者中，有17例结果显示血浆循环核酸p53基因突变；有转移病灶组18例的突变率高于无转移病灶组15例. 结论： 血浆p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的发生、与疾病的轻重及病灶转移有相关性，突变机率在临床鉴别诊断和预后中有价值.
【关键词】 基因，p53；基因，p16；癌，肝细胞
0引言
在各类疾病中，肝癌以恶性程度高、治疗效果差、病灶易转移和给患者带来极大身心损害而排在前列［1］. 检测血浆中p53和细胞核中p16基因突变机率，对治疗效果判定、康复干预都有参考和使用价值［2］，对肝癌的发生和发展的危险因素评估、早期预防提供实验方法学.
1材料和方法
1.1材料收集病例35例，患者均经腹部B超、CT或MRI影像学诊断，CEA, AFP多项肿瘤标志物蛋白检测. 有胸腹水患者21例抽取样本进行组织细胞学，4例肝穿刺活检病诊断. 21例术后证实为肝癌，12例失去手术机会，2例因病情恶化死亡. 本组研究实为33例，肝癌无转移15例，肝癌合并肺、胃、肠、脑等部位转移癌18例. 男性27例，女性6例，年龄27~69（中位年龄48.27岁）. 自静脉采血分离血浆，不受时间、饮食和治疗影响. 31例正常对照为献血员血浆，男性20例，女性11例，年龄25~55岁（中位年龄42.93岁）.
1.2方法PCR扩增仪使用美国PE公司智能型热循环仪，引物设计参照序列如下［3］：p53基因外显子5，扩增第5个显子（P56.1和P5.2）序列上游引物顺序5′TTC CTC CTG CAG TAC C3′, 214 bp，上游引物顺序3′GCC CCA GCT GCT CAC CAT3′；p53基因外显子6，扩增第6个显子（P6.1和P6.2）序列上游引物顺序5′CAC TGA TTG CTC TTA GGT CT3′, 144 bp，上游引物顺序5′AGT TGC AAA CCA GAC CTC AGG3′；p53基因外显子7，扩增第7个显子（P7.1和P7.2）序列上游引物顺序5′TCT CCT AGG TTG GCT CTG AC3′, 133 bp，上游引物顺序5′CAA GTG GCT CCT GAC CTG GA3′；p53基因外显子8，扩增第8个显子（P8.1和P8.2）序列上游引物顺序5′CCT ATC CTG AGT ACT GGT AA3′, 166 bp，上游引物顺序3′GTC CTC CTT GCT TAC CTC G3′.
DNA提取方法为静脉血2.5 mL，EDTAK2抗凝，混匀后3500 r/min离心10 min，分离血浆低温-20℃保存. 操作程序按DNA提取试剂盒（由博华公司提供QLAmp DNA minikit，Germany）说明书进行. PCR扩增循环条件为：95℃ 40 s， 60℃ 30 s， 75℃ 40 s，重复循环32次，70℃ 10 min完成延伸反应. 再经非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳，银染，应用凝胶自动成像系统分析. 阳性（基因突变）条进行基因测序.
免疫组织化学方法采用SP方法，p16单克隆Ab及SP试剂购自成都医药总公司. p16蛋白以细胞核染棕兰色为阳性，每张切片中以东西南北中五个高倍镜下视野计数，按100%. 判定标准为阳性细胞数≥5%. 阳性对照同批实验对照.
2结果
2.1p53基因突变p53基因突变与转移癌的相关性（表1）和p53基因突变分布有区别（表2）.
表1小细胞肝癌（HCC）p53基因突变与转移癌的关系（略）
表217例肝癌患者血浆p53基因热点区外显子突变的分布（略）
2.2p53基因突变相关性分析正常对照血浆31份，结果均为阴性（未发现泳动变位），33例肝癌患者血浆，有17例结果为阳性（有泳动变位）. 33例肝癌血浆p53基因有突变的17例（17/33, 51.55%），在第8外显子居多（6/17, 35.4%）. 5~8外显子扩增结果表明，HCCp53基因发生突变的机率在临床有转移的HCC中明显高于无转移的HCC（P<0.05）. 因此在一定程度上提示出抑癌基因突变与肿瘤发生事件有关，并与肿瘤恶性程度、病情轻重程度有关(χ2=67.33, P<0.05).
2.3p16基因缺失p16基因缺失情况见表3. 阳性为细胞核内着棕兰色颗粒,均匀散在分布. 随采样位置,显示无转移癌组织切片>有转移癌组织切片，分别为88.9(16/18)% 和11.1(2/18)%,统计学分析存在显著性差异(χ2=6.095，P<0.01).
表3p16基因缺失程度与癌组织是否转移的相关性（略）
3讨论
目前已知的抑癌基因有数十种，随着人类基因组计划的进行；其数目不断增加，由于功能效团最终聚到细胞增殖调控机制上来［4］，在人体的各种细胞中都有p53蛋白质，由于含量很低、半衰寿期很短，一般检测方法无法测到. p53有抑制细胞生长的作用［5］. 从以上实验可知：在33个病例中有17例患者HCC的p53基因发生突变，占51.52%. 由于p53基因的突变或缺失导致p53基因功能的改变或丧失，从而不能抑制细胞的生长. 在HCC患者中p53发生突变，抑制细胞生长的作用随之降低，导致癌细胞的快速增长，在同等条件下，发生HCC转移的机率将比p53未发生突变的大，从实验数据显示HCC有转移的占66.6%，HCC无转移的占29.5%. 表明在肝癌患者中HCC p53基因突变与癌转移有一定的相关关系，以上实验从5~8外显子扩增结果表明，HCCp53基因发生突变的机率在临床有转移的HCC中明显高于无转移的HCC（P<0.05），因此在一定程度上提示出抑癌基因突变与肿瘤发生事件有关，并与肿瘤恶性程度、病情轻重程度有关. 人类p53基因的突变形式表现为点突变、缺失突变、移码突变和基因重排等［6］. 突变位点多集中在第5~8外显子. 实验显示在17例p53基因突变中，第5个外显子占17.1%，第6个外显子也占17.1%，第7个外显子占29.4%，第8个外显子占35.4%. p53基因突变的一个特点是引起蛋白质功能改变的错义突变，少数是无义突变或终止突变［7］在原发性肝癌中，p53基因点突变是最为频发的事件，p53等位基因杂合型缺失频率可达25%~60%. 在技术方法的不断进步和研究的不断深入，癌基因、抑癌基因的检测在肿瘤的早期发现、鉴别诊断、疗效评估和康复干预等具有重要价值［8］.
p16基因（MTS1，CDR41，CDRN2）是细胞周期调空基因家族中的重要成员［9］，是近年来新发现的抑癌基因，其作用机制为直接抑制. 实验表明，随采样位置显示：无转移癌组织切片＞有转移癌组织切片，分别为88.9(16/18)% 和11.1(2/18)%, 存在显著性差异(P<0.01). p16的主要作用是特异地抑制细胞周期素D细胞周期素依赖性交合体对细胞G1期到S期的调控，当其缺失或失活时，交合体则持续高活性的存在于细胞内导致PRB基因的磷酸化，释放转录因子E2F等，激活多种细胞增殖的相关因子［10］，从而导致细胞G1期到S期的失控，细胞发生异常增殖，导致最后的恶变. 故研究p16基因的缺失程度对研究肝癌的发生、、诊断、和康复具有重要的意义.
结论： 核酸（RNA和DNA）的PCR扩增已成为分子生物学研究的重要技术体系，本研究在国内较早将其用于肝癌血浆p53基因突变的检测，同时观察基因p16缺失的情况，不仅从分子水平精确地阐明机制，也为基因诊断和基因治疗提供了实验依据，尽管目前仍存在一定的局限性，尚不能确定特异的对应关系，但无疑是一种前景广阔的发展方向，处于学科前沿.
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