polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性

【关键词】  DNA聚合酶β； 转染；食管肿瘤；肿瘤细胞，培养的；抗药性，肿瘤；四甲基偶氮唑蓝

　　DNA聚合酶beta (polymerase beta gene，polβ)广泛存在于哺乳动物细胞核内，是一条Mr为39×103的单肽链小分子蛋白，由355个氨基酸组成，是目前已知的最小的DNA聚合酶. 在碱基切除修复，DNA复制，跨损伤合成中发挥重要作用，还与基因组不稳定性有关［1-4 ］. 近年来的研究表明在多种肿瘤组织及肿瘤细胞株内polβ  mRNA的表达都明显增加［5-6］. polβ与肿瘤细胞耐药性的关系也逐渐引起人们的注意. 本实验通过研究人食管癌顺铂(concentration of cisplatin, cDDP)耐药细胞系Ec9706/cDDP和稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞中polβ的表达水平及其对抗肿瘤药cDDP的敏感性，旨在进一步探讨polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人食管癌细胞株Ec9706由医学院肿瘤研究所提供；cDDP山东齐鲁药业股份有限公司产品；RPMI 1640培养液Gibco/ BRL公司生产；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma产品；pEGFP?C3 (Clonetech公司)；野生型人polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP?AC3(微生物学与免疫学教研室赵国强教授惠赠)；G418(宝生物公司)；6?TG (美国Sigma公司)；LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）；引物2对，由上海生工公司合成：polβRNA检测引物：上游5′TGTTTGCCAGCTTCCC AGTA3′，下游5′CTCCA GTGACTCCCAAGGGA3′，扩增长度206 bp；β?actin引物:上游5′TC AAGATCATTGCTCCTCCTGA3′，下游5′CTCGTCATACTCCTGCTT GCTG 3′，扩增长度113 bp.

　　1.2方法

　　1.2.1cDDP诱导耐药细胞系Ec9706/cDDP的建立

　　采用cDDP中等浓度、间歇作用方法建株. 以终浓度为2 mg/L的cDDP培养基冲击对数生长期的Ec9706细胞，48 h后弃去含药培养基，PBS洗3次，换新鲜培养基. 1～2 d换液1次，洗去死亡细胞，待形成细胞克隆时传代，恢复稳定生长后提高cDDP浓度再次冲击，如此反复作用直至细胞可在浓度为0.5 mg/L的cDDP培养液中维持培养.
 
　　1.2.2稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞系的建立

　　取对数生长期Ec9706细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，待细胞融和度达60%～70%时，以正常Ec9706细胞作对照，分组转染pEGFP?C3 (空质粒)和pEGFP?AC3，按转染试剂LipofectamineTM 2000操作说明书进行. 4～6 h后，弃转染液换2 mL含10 mL/L胎牛血清的培养液继续培养. 48 h后以含750 mg/L G418的培养液筛选，约14 d后对照Ec9706细胞全部死亡，转染组改用含200 mg/L G418的培养液，阳性克隆扩大培养后，建立稳定传代转染细胞系. 转染pEGFP?C3, pEGFP?AC3的细胞分别用Ec9706?C3, Ec9706?AC3表示.

　　1.2.3细胞形态学观察普通倒置显微镜下观察各组细胞形态，荧光显微镜观察转染后细胞绿色荧光.

　　1.2.4RT?PCR检测polβ mRNA的表达取细胞各1瓶，按Trizol试剂盒说明书抽提细胞总RNA，逆转录后PCR扩增. PCR反应体系30 μL： 10×buffer  3 μL，dNTP 2.4 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 U，逆转录产物5 μL. PCR反应条件: 94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35个循环后，72℃延伸5 min. 15 g/L琼脂糖凝胶电泳. SYNGENE凝胶分析系统软件分析电泳结果，用polβ与β? actin积分吸光度值的比值表示polβ基因的相对表达水平.

　　1.2.5MTT法测细胞对cDDP敏感性的变化常规MTT法检测，酶标仪以波长550 nm测各孔A值，相对抑制率（％）＝（1-加药孔A值/对照孔A值）×100％，用IC50计算器软件计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度( IC50)，耐药指数(RI) =待测细胞IC50/ Ec9706细胞IC50.

　　统计学处理： 用SPSS 10.0统计软件处理数据，数据以x±s表示，t检验，α=0.05.

　　2结果

　　2.1各组细胞形态

　　经过9 mo的体外诱导筛选获得了在含0.5 mg/L的cDDP培养液中生长良好的耐药细胞系Ec9706/cDDP. 诱导过程中在加入cDDP后24 h倒置显微镜下可见大部分细胞因死亡而漂浮起来，培养液略浑浊，残留贴壁细胞发生明显改变，大小不均匀，有巨细胞产生，形态不规则，细胞突起及部分细胞质中黑色颗粒较多，生长缓慢，于20 d左右可形成细胞克隆，传代后逐渐接近原来细胞形状（图1）. 此外，倒置显微镜下观察转染前后细胞形态无明显差异，均呈多角形或圆形；在荧光显微镜488 nm波长下Ec9706?AC3与Ec9706?C3细胞呈现绿色荧光，而对照Ec9706细胞则无荧光.

　　2.2RT?PCR结果

　　耐药细胞Ec9706/cDDP与亲本细胞RT?PCR后电泳结果见图2. 经灰度扫描后两种细胞内polβ mRNA与β?actin相比其相对表达水平分别为0.49±0.09，0.81±0.16，Ec9706/cDDP中polβ的表达高于亲本细胞（P<0.05），是亲本细胞的1.65倍；转染细胞RT?PCR后电泳结果见图3. 经灰度扫描后Ec9706，Ec9706?C3及Ec9706?AC3细胞内polβ  mRNA与β?actin相比，其相对表达水平分别为0.52±0.13，0.48±0.11，1.21±0.15，表明Ec9706?AC3细胞内polβ的表达高于Ec9706及Ec9706?C3细胞（P<0.05），是Ec9706细胞的2.33倍；而Ec9706?C3细胞内polβ的表达与Ec9706细胞相比较差异无统计学意义（P>0.05）. A: 正常不加药的Ec9706细胞；B: 加药后24 h细胞；C: 加药后20 d左右形成的克隆；D: Ec9706/cDDP细胞.

　　2.3各组细胞对cDDP的敏感性

　　经MTT法检测，人食管癌cDDP耐药细胞系Ec9706/cDDP的耐药指数为15.70. 而Ec9706?AC3对cDDP的耐药指数为1.78，与Ec9706相比对cDDP的敏感性显著降低（P<0.05），而对照转染空质粒的Ec9706?C3的IC50是Ec9706的0.97倍，与Ec9706相比对cDDP的敏感性无明显改变（P>0.05）.

　　3讨论

　　肿瘤细胞的耐药机制有多种，包括药物的蓄积降低、细胞解毒功能的增强、药物靶蛋白（如拓扑异构酶TPO）量或活性的改变等. 通常MRP, mdr1, GST, TPO与二氢叶酸还原酶等基因的异常表达与肿瘤的耐药关系密切［7-8］. 近年来，DNA修复能力增强（如polβ表达增强）与耐药性的关系也逐渐引起人们的注意. polβ于1971年由Weissbach等［9］在牛胸腺细胞中发现，通常情况下在体内恒定低水平表达，主要参与DNA修复，在碱基切除修复（base excision repair, BER）的过程中填补单核苷酸缺口，碱基掺入过程有很高的错误率，体外DNA聚合反应中单碱基错误掺入率为1/1000～1/6600，是哺乳动物体内复制保真度最低、最不精确的一种DNA聚合酶［10-11］. 细胞为了正常分化以及DNA的正常复制与修复，polβ在细胞内的表达水平必须维持到一个适量的稳定水平. 当polβ高表达时，可导致细胞自身突变率增加、遗传不稳定性的发生以及对一些抗癌药物产生耐受. 有学者报导，将表达polβ的质粒转染如仓鼠卵巢细胞中发现转染细胞对cDDP等化疗药物的敏感性降低［3］. 对cDDP耐药的卵巢癌细胞株中polβ的表达比亲本细胞增加了8倍［12］. 本研究诱导建立了人食管癌cDDP耐药细胞系Ec9706/cDDP，该细胞耐药指数达15.70，细胞内polβ表达是亲本食管癌细胞Ec9706的1.65倍；同时采用脂质体转染法将人野生型polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP?AC3导入食管癌细胞Ec9706后，其polβ表达是Ec9706细胞的2.33倍，对cDDP的敏感性降低，耐药指数为1.78. 这些均表明polβ的高表达与肿瘤细胞对cDDP等的耐药有关，polβ的高表达可引起耐药性的产生，耐药细胞中polβ的表达也会增高. 同时，研究发现转染有polβ表达载体的Ec9706?AC3细胞内polβ的表达高于耐药细胞Ec9706/cDDP，而其耐药指数却低于Ec9706/cDDP细胞，说明体外诱导产生的耐药细胞Ec9706/cDDP的耐药机制有除polβ外其它机制的参与.

【】
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