Fas/FasL系统在人子宫内膜增生过长和子宫内膜癌中的表达

【摘要】  目的： 探讨Fas和Fas配体（FasL）在人子宫内膜增生过长和子宫内膜癌发病中的作用. 方法： 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶染色法（SP法）检测40例子宫内膜增生过长的异位内膜与18例子宫内膜癌内膜中Fas和FasL蛋白的表达；采用原位杂交方法检测FasL mRNA水平. 设正常子宫内膜25例为对照组. 结果： Fas蛋白在正常子宫内膜的阳性表达率为68%，在子宫内膜增生过长与子宫内膜癌组的阳性表达率分别为58％和22％，差异具有统计学意义（P<0.05）. FasL蛋白在子宫内膜增生过长与子宫内膜癌组中的阳性表达率分别为68%和94%，明显高于对照组32%，差异具有统计学意义（P<0.05）. FasL mRNA的表达强度在子宫内膜增生过长与子宫内膜癌组亦明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）. 结论： Fas与FasL蛋白表达失调，可能是子宫内膜增生过长的发病机制之一，对子宫内膜癌组织逃避免疫系统监视具有重要作用.

【关键词】  Fas；Fas配体；子宫内膜增生；子宫内膜肿瘤

　　Fas/FasL系统的生理功能在于通过对细胞凋亡的调节，限制某些细胞群落的过分膨胀或过分萎缩，参与正常细胞增殖、分化和凋亡动态平衡的维持，在临床多种疾病的发生过程中具有重要的作用［1-2］. 近年的研究发现，在多种肿瘤细胞出现Fas表达下调和 FasL表达上调的现象, 直接参与或间接促进了肿瘤逃避机体免疫系统的监视,从而有利于肿瘤细胞的进展和转移［3］. 但有关Fas/FasL系统与子宫内膜增生过长和子宫内膜癌发生中的作用少见报道. 本实验采用免疫组化和原位杂交方法检测Fas/FasL系统在子宫内膜增生过长和子宫内膜癌中的表达，旨在探讨其在子宫内膜癌发生中蛋白及基因表达的意义，为临床诊断和提供依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　选用第四军医大学西京妇产科2002?01/2003?04手术切除子宫标本83例. 分为子宫内膜腺癌组18例，年龄（44.2±7.8）岁；子宫内膜增生过长组40例，年龄（44.5±8.2）岁；以正常子宫内膜25例作为对照组，年龄（45.5±7.6）岁. 子宫内膜腺癌采用国际妇产科联盟（IFGO）的三级分类法分为I级7例，II级5例，III级6例. 子宫内膜增生过长按1985年国际妇科病理协会提出的分类标准进行分类，根据腺体增殖程度及腺上皮有无非典型性（atypical，ATP）分为四类：单纯性增殖不伴ATP 11例，单纯性增殖伴有ATP 12例，复杂性增殖不伴ATP 9例，复杂性增殖伴有ATP 8例.
　　
　　Fas和FasL多克隆抗体（兔抗人）及通用型超敏SP kit（福州迈新试剂公司）；FasL原位杂交试剂盒（武汉博士德试剂公司）；地高辛标记的FasL mRNA多相寡核苷酸探针序列为：① 5′?CCCAG ATCTA CTGGG TGGAC AGCAG  TGCCA?3′，② 5′?TATTC CAAAG TATAC TTCCG GGGTC AATCT?3′，③ 5′?CTCTC  TGGTC  AATTT  TGAGG  AATCT  CAGAC?3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1免疫组化SP法测定

　　Fas和FasL蛋白的表达水平标本经40 g/L多聚甲醛固定，石蜡切片厚4  μm，抗原经微波热修复，Fas及FasL一抗的工作浓度均为1∶100，DAB显色. 操作方法按试剂盒说明书进行.

　　1.2.2原位杂交法测定

　　FasL mRNA石蜡切片常规脱蜡至水，30 mL/L H2O2室温处理10 min，DEPC水洗2×5 min，用胃蛋白酶37℃消化30 min，0.5 mol/L PBS洗3×5 min，进行40℃预杂交3 h，用滤纸吸去预杂交液，加入FasL mRNA探针的原位杂交液杂交过夜. 以链霉素?过氧化物酶（SABC）免疫组化法染色，DAB显色. 操作方法参照说明书进行.

　　1.2.3对照设计

　　免疫组化分别用已知Fas和FasL均阳性的乳腺癌组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照. 原位杂交用杂交试剂盒内配置的阳性切片作为阳性对照，杂交过程中加不含标记探针的原位杂交液作为阴性对照.

　　1.2.4结果判定

　　免疫组化和原位杂交染色，以黄色和棕黄色为阳性信号. 根据染色强度和显色细胞比例的综合评分，将染色结果分为“-，+, ?, ?”四级： ① 按内膜组织中显色有无及深浅评分：无显色为0分，浅黄色或黄色为１分，棕黄色为2分，棕褐色为3分. ② 按内膜组织的显色比例评分：＜5%为0分，5%～25％为1分，25%～50％为2分，＞50%为3分. 每例标本的积分为（①＋②）/2，按积分高低分为：0分为阴性（-），0.5～1分为弱阳性（+），1.5～2分为阳性（?），2.5～3分为强阳性（?）.

　　统计学处理：应用SPSS 11.0软件进行统计分析. FasL，Fas及FasLmRNA表达的强弱程度用Kruskal?Wallis检验，组间多重比较采用Nemenyi检验.

　　2结果

　　2.1FasL/Fas蛋白的表达三组间年龄差异无统计学意义. FasL蛋白在子宫内膜增生过长组与子宫内膜腺癌组中的阳性表达率分别为68%和94%，均明显高于正常子宫内膜对照组32%，差异具有统计学意义（P<0.05，表1）. Fas蛋白在正常子宫内膜对照组的阳性表达率为68%，在子宫内膜增生过长组与子宫内膜腺癌组的阳性表达率分别为58％和22％，差异具有统计学意义（P<0.05）. 表1FasL, Fas在各种子宫内膜癌中的表达(略)

　　2.2FasL基因的表达FasLmRNA的表达

　　强度在子宫内膜增生过长组与子宫内膜癌组亦明显高于正常子宫内膜对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）. 表2FasL mRNA在各种子宫内膜中的表达(略)

　　3讨论

　　Fas及FasL蛋白在正常子宫内膜中的生理性表达，有利于维持细胞增殖和细胞凋亡平衡［2］. Fas的表达随月经周期波动，在增生期无表达或弱表达，而在分泌期则逐渐增强；FasL在整个月经周期中呈阴性表达或弱表达，且不随月经周期波动［3］.

　　二者主要定位于功能层腺上皮细胞的胞质中. 在月经周期中激素水平不断变化的情况下，Fas/FasL系统在调节正常内膜组织的增殖平衡与结构再建中起重要作用［4-5］. 我们的实验结果表明，子宫内膜腺癌Fas表达的阳性率明显低于子宫内膜增生过长，子宫内膜腺癌FasL蛋白及基因的表达的阳性率明显高于子宫内膜增生过长 ，FasL蛋白及基因的表达在子宫内膜增生过长中明显高于正常子宫内膜 (P<0.05)，但在子宫内膜增生过长及子宫内膜腺癌各型之间却无显著性差异(P>0.05). 这与国外学者的研究结果一致［5］.

 　　Fas抗原属于神经生长因子/肿瘤坏死因子受体超家族的成员之一［6］. FasL是Fas抗原的配体，属于TNF家族,两者结合可导致细胞调亡［7］. Fas/FasL系统参与子宫内膜增生过长的形成［8］. 正常功能时，Fas通过诱导凋亡而作为肿瘤抑制因子，Fas信号失活导致细胞凋亡失败、不正常细胞生存、肿瘤形成.
赵向阳等［9］的研究发现，Fas在癌变组织中表达的下调，细胞凋亡减少，而FasL则与Fas在胃癌发生过程中的表达呈现相反趋势,表达强度呈增强趋势,这种Fas/FasL的不协调表达可能也是造成胃癌细胞凋亡减弱的原因之一. 我们研究表明子宫内膜癌Fas表达降低，导致Fas介导的细胞凋亡相对减少，细胞增殖相对增加. 这可能是子宫内膜癌发病机制之一.

　　综上，子宫内膜癌FasL表达增高和Fas的低表达，可导致细胞对局部免疫细胞产生抑制，对周围正常组织的侵袭，使子宫内膜癌得以发生、发展.
　　

【】
  　　［1］Bohana?Kashtan O, Civin Cl. Fas ligand as a tool for immunosuppression and generation of immune tolerance［J］. Stem Cells, 2004, 22 ( 6): 908-924.

　　［2］李海民，窦科峰，帝振宇，等. 肝内嵌合Sertoli细胞对肝组织中Fas/FasL表达的影响及其意义［J］. 第四军医大学学报，2003，24(12):1091-1093.

　　［3］王滨，郑维国，辛晓燕，等. Fas/FasL系统在子宫内膜异位症中的表达与意义［J］. 山西医科大学学报，2003，34:490-492.

　　［4］Wang S, Pudney J, Song J, et al. Mechanisms involved in the evolution of progestin resistance in human endometrial hyperplasia??precursor of endometrial cancer［J］. Gynecol Oncol，2003，88(2):108-117.

　　［5］Taylor DD, Lyons KS, Gercel?Taylor C, et al. Shed membrane fragment?associated markers for endometrial and ovarian cancers［J］. Gynecol Oncol, 2002,84(3):443-448.

　　［6］桑威. Fas/FasL系统参与的几种生物学效应［J］. 国际免疫学杂志，2006,11(9):389-392.

　　［7］Iwase M, Kondo G, Watanabe H, et al. Regulation of fas?mediated apoptosis in neutrophils after surgery induced acute inflammation［J］. J Surg Res, 2006,134(1):114-123.

　　［8］Wang S, Pudney J, Song J, et al. Mechanisms involved in the evolution of progestin resistance in human endometrial hyperplasia??precursor of endometrial cancer［J］. Gynecol Oncol, 2003,88:108-117.

　　［9］赵向阳，王为忠，李玉红，等. Fas, FasL和Bcl?2在胃癌发生发展中的表达意义［J］. 第四军医大学学报，2003,24(10):938-939.