拟apoE对小鼠蛛网膜下腔出血及脑血管痉挛的治疗作用

【摘要】  目的： 探讨新合成的拟载脂蛋白E（apoE）对蛛网膜下腔出血（SAH）的作用及机制. 方法： 55只C57BL6/JL小鼠随机分为： 假手术组，SAH组，低剂量（SAH＋apoE?1410， 0.6 mg/Kg）组和高剂量（SAH＋apoE?1410， 1.2 mg/Kg）组. 显微操作戳破右侧大脑中动脉(MCA)和大脑前动脉(ACA)分叉处造成SAH模型. 术后30 min开始经尾静脉给药，每12 h一次，连用3 d. 每日检测小鼠的一般精神状态、神经功能评分、综合运动能力评分. 术后第3日测量MCA直径. 结果： 术后SAH组小鼠精神萎靡，食欲下降，有的难进食水，体质量下降，死亡率为42.8％. 高、低剂量组与SAH组比较，一般症状明显减轻，死亡率分别为14.2％和18.8％，与SAH组比较，显著降低（P<0.05）. MCA直径在假手术组为（111.3±7.4）μm，与SAH 组（55.2±17.8） μm比较，平均缩小了59%（P<0.05）；低、高剂量组MCA分别为（91.4±16.4）μm和（83.5±13.6）μm，与SAH组（55.2±17.8）μm比较，MCA痉挛程度下降（P<0.05）. 神经功能评分在SAH组（6.7±1.8）明显低于假手术组（21.0±0.0, P<0.05）；高剂量组（10.6±4.8）、低剂量组（10.9±2.6）的神经功能评分分别明显高于单纯SAH组（6.7±1.8, P<0.05）；但在两个剂量组间未见差别（P>0.05）. 综合运动能力评分在SAH组（58.8±25.7）明显低于假手术组（272.2±25.7, P<0.05）；高剂量组（95.5±13.2）,低剂量组（95.6±18.5）的综合运动能力分别明显高于单纯SAH组（58.8±20.9, P<0.05）. 结论： 外源性拟apoE对SAH及脑血管痉挛有一定的治疗作用， 其机制与降低神经系统对损伤的炎性反应有关，拟apoE有可能成为治疗SAH的新措施.

【关键词】  蛛网膜下腔出血；拟apoE；apoE基因；脑血管痉挛

　　载脂蛋白E（apoliopoprotein E， apoE）在中枢神经系统的生理、病理作用越来越受到重视. 完整的apoE分子量大，正常状态下不能通过血脑屏障，限制了其作为外源性药物的治疗性应用［1］. 内源性apoE或脑室内注射apoE全蛋白通过下调中枢神经系统炎症反应、减轻氧化应激、抗兴奋性氨基酸毒性、直接增加神经营养等作用发挥神经保护作用［2］拟apoE（133?149）是体外重组来自apoE受体结合区的一个17肽，外源性给药能透过血脑屏障，同时保留了apoE全蛋白的许多特性［3-4］. 但有关体外重组apoE片断用于SAH的治疗性研究，目前国内外还少见报道. 蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）患者脑脊液apoE水平下降，提示apoE与SAH的病理机制有关［5-6］. 本研究采用静脉给药，旨在探讨拟apoE?1410对实验性SAH及脑血管痉挛是否具有治疗作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　拟apoE?1410的合成：拟apoE?1410， cetyl?AS?Aib?LRKL?Aib?KRLL?amide，12肽，分子量：1410D. 由北卡罗来纳州立大学肽合成实验室合成. Leica手术显微镜（德国Leica公司）；显微手术用器械，包括弯头手术镊，手术剪刀，阻血夹及其持器等（瑞士）. 小动物呼吸机，麻醉机，血气分析仪（美国Harvard公司）；转棒仪（意大利Ugo Basile公司）；图像采集及图像分析系统(加拿大图像研究公司，型号MCID?M5)；脑血管灌注装置，灌注胶（杜克大学多学科神经保护实验室）.

　　1.2方法
 
　　1.2.1动物分组及SAH模型制备

　　C57BL6/J L雄性小鼠55只，12～14 wk. 随机分为4组：假手术组（4只）；SAH（SAH+盐水）组（21只）；低剂量（SAH＋apoE?1410 ，0.6 mg/kg）组（14只）和 高剂量（SAH＋apoE?1410，1.2 mg/kg）组（16只）. 将小鼠气管插管，连接呼吸机，监测血压、血气和体温，控制在生理状态，显微手术戳破大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)和大脑前动脉(anterior cerebral artery，ACA)分叉处造成SAH模型. 拟apoE?1410溶于PBS，经尾静脉注射，SAH术后30 min开始第一次，每12 h 一次，共用3 d，其它两组只注射生理盐水.

　　1.2.2神经功能检测评分

　　［7］的方法进行. 神经行为学主要检测动物的面、颈部触觉，足掌痛觉，自由活动，双前肢对称性，攀爬能力，平衡运动能力等. 检测总分为3～21分. 其中运动功能检测0～12分，感觉功能检测3～9分.

　　1.2.3转棒实验应用

　　转棒仪检测小鼠左右肢体的协调能力、平衡能力、体力与耐力等综合运动能力. 该仪器由一根直径为3 cm的转棒和齿轮传送系统以及数显系统构成，在电力推动下进行加速度转动，最高转数为300转/分. 在手术前一天上午（分组之前），对所有小鼠进行训练. 将小鼠放置在静止的转棒上，开动机器，开始加速度转动，小鼠可能会掉落，重新放回转棒，共重新放回转棒3次. 休息10 min之后，进行第2次训练，同样的训练共进行3次. 获取基数值：在上午接受3次训练之后，下午取每1只鼠的基数值. 在转棒静止状态，将小鼠轻轻放在转棒上，开动机器，开始加速度转动，记录小鼠掉落的时间，或者记录当小鼠四肢抱住转棒，不能走动达到2圈，即360度时的时间，单位为秒（s），共测定3次，每次之间至少间隔10 min，取其均值为手术前的基数. 训练的目的是让所有实验组的小鼠均接受同样的学习训练，每只鼠的基数虽有微小差别，但可以视为相同. 术后第2日开始，每日进行1次，共3 d. 具体做法与取得基数时一致.

　　1.2.4脑血管铸型及脑血管直径的测量

　　术后72 h行脑血管灌注，测量伤侧MCA距与ACA分叉处1.00 mm处的直径.

　　1.2.5出血等级的判定

　　参考文献［7］的方法进行. SAH术后72 h，判定出血等级. 将脑血管铸型的标本放置于生理盐水中，手术显微镜下放大6倍，进行出血等级的判定. 以出血块的面积和出血块的密度为依据将出血量分为3个等级. 出血块面积在距离MCA?ACA分叉处<1.0 mm为1级；>1.0 mm 为2级；>1.0 mm,同时出血面积超过了ICA为3级. 出血密度：透过血块能观察到脑实质为1级；透过血块看不到脑实质为2级；根本无出血块者为0级. 综合出血面积和密度，出血等级为2～5级.

　　统计学处理：   应用SPSS 11.0统计分析软件进行数据分析，数据以x±s表示. 转棒实验结果应用重复测量的方差分析，两组间比较用Scheffe检验. MCA和神经行为学检测结果应用Kruskal?Wallis 检验. 出血等级资料，属非参数统计，用秩和检验. 死亡率用χ2检验.  P<0.05 为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1神经功能学评价

　　术后SAH组小鼠的局部感觉障碍，表现为患侧对侧的面部、胡须的触觉和耳后皮肤的触觉的受损. 患侧对侧的前肢肌力下降，呈现双前肢伸直不对称，用手提起尾巴令其前行时，向左侧倾斜，甚至向左侧原地转圈. 同时攀爬能力、平衡能力和本体感觉等均下降，体力与耐力受损，精神状态不佳，食欲下降，难进食水，体质量减轻等. 神经功能评分SAH组小鼠明显低于假手术组（P<0.05）；高、低剂量组明显高于SAH组（P<0.05，表1）. 综合运动能力评分SAH组小鼠明显低于假手术组（P<0.05）；高、低剂量组明显高于SAH组（P<0.05）；但在两个剂量组间未见差别（P>0.05，表2).表1神经功能评分各组间比较(略)表2综合运动能力评分各组间比较(略)

　　2.2出血等级SAH术后，无论SAH组还是高、低剂量组小鼠，颅底均有出血，主要围绕MCA和ACA分叉分布，有的波及到整个颅底. SAH组（在出血等级2, 3, 4级者，分别有2, 4, 6只）与低剂量组（在出血等级2, 3, 4级者，分别有2, 4, 6只）和高剂量组（在出血等级3, 4级者，分别有6, 7只）三组之间，出血等级无差异（秩和检验，χ2=0.511, P=0.775）. 出血等级的判定，可以规范实验各组小鼠的出血损伤程度，在各组间出血等级无统计学差异的前提下，方可进行其他数据的比较.

　　2.3MCA直径测量结果高、低剂量组分别与SAH组比较，MCA 直径均显著缩小（P<0.05,表3). 表3MCA直径各组间比较(略)

　　3讨论

　　新的拟apoE?1410能减轻SAH引起的脑血管痉挛程度，改善SAH的预后,对SAH有作用. 有研究报道，连续脑室内注入生理剂量来自人血浆的apoE或人类重组apoE，可部分逆转APOE基因缺陷鼠大范围的神经损伤 ［8］，说明外源性脑室内注射apoE对急性脑损伤也有一定的保护作用. Lynch等 ［5］用重组apoE片断（133?149）经鼠尾静脉注射后5 min，脑内apoE含量升高，与给药浓度呈正相关，提示重组apoE片断可以通过血脑屏障. 同时发现apoE（133?149）是通过apoE全蛋白同样的受体起作用，降低神经炎性反应，阻断NMDA造成的细胞毒性，抗氧化损伤等发挥神经保护作用［9］. 本实验采用新的体外重组的拟apoE?1410短肽，经静脉给药，发现高、低剂量组的MCA痉挛程度与SAH组比较有显著改善，从精神状态、神经功能评分和死亡率等综合效果来看，apoE?1410确实对SAH起到了一定的治疗作用. apoE?1410有可能成为比apoE（133?149）疗效更好的神经保护药物.
　　
　　抗炎症作用是apoE?1410对SAH的治疗作用机制之一. 内源性apoE蛋白的生理机能之一是降低神经胶质对炎症的反应 ［10］，来自apoE受体结合区的拟apoE 17肽（133?149）在体外和体内均发挥了抗炎作用 ［5］. 我们推测拟apoE?1410肽对SAH后脑血管痉挛的缓解和神经功能状态的改善的作用机制可能与其抗炎症作用有关，进而减轻脑血管痉挛，降低了延迟性脑缺血程度，减轻了继发性损害. 这些与在临床上已被证实的apoE对其它疾病的预后有积极作用的报道相一致 ［11-12］. 当然，apoE的神经保护作用机制还有其他许多可能，例如创伤后apoE基因缺失鼠脑抗氧化水平严重降低等［11］. 有关apoE的神经保护作用机制可能是多方面的，尚待深入探讨.

【】
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