椒目油对大鼠气道重建的防治作用

【摘要】  目的： 研究椒目油对哮喘大鼠模型Ⅲ型胶原、增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平及气道重建的影响，为椒目的临床应用提供理论依据. 方法： 将雄性SD大鼠30只随机分为3组：哮喘组、组、对照组，每组动物10只，用卵白蛋白(OVA) 腹腔注射致敏和雾化吸入激发建立哮喘大鼠模型，采用机图像分析免疫组化气道璧中Ⅲ型胶原的表达，并测量各组支气管壁的厚度. 结果： 免疫组化结果显示,Ⅲ型胶原阳性表达的平均吸光度:哮喘组大鼠(19.24±0.24)明显高于对照组(2.75±0.22， P<0.01);治疗组(10.16±0.37)明显低于哮喘组 (P<0.01) .PCNA的表达哮喘组明显高于对照组(P<0.05);治疗组低于哮喘组(P<0.05).哮喘组支气管壁厚度(10.24±2.05)明显高于对照组(5.81±0.73， P<0.01);治疗组(8.45±1.67)明显低于哮喘组(P<0.01). 结论： 椒目油不但能有效治疗哮喘，而且还能有效防止气道重建，其作用机制可能是抑制了Ⅲ型胶原和PCNA的生成.

【关键词】  椒目油；哮喘；气道重建；增殖细胞核抗原；胶原Ⅲ型

　　中药椒目治疗支气管哮喘悠久，具有很好的疗效，目前国内许多单位相继开展了椒目治疗哮喘研究，取得一定成果［1］. 从国内大量的报道以及研究成果显示，无论从分子生物学的角度或是从临床的角度都说明了椒目能有效治疗哮喘.但是椒目是否能有效地防止气道重建，目前还少见报道.为此我们进行了这方面研究，以探讨椒目油对气道重建的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g（第四军医大学实验动物中心）；椒目油（第四军医大学西京药剂科，批号：20050221）；卵白蛋白(ovalbumin, OVA，美国Sigma公司）；超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)；SP?2000彩色图像分析系统(上海世珈医疗设备有限公司)；小鼠抗大鼠Ⅲ型胶原, 增殖细胞核抗原（proliferating cell  nuclear  antigen, PCNA）多克隆抗体， SABC 免疫组化试剂盒(武汉博士德生物有限公司).

　　1.2方法
 
　　1.2.1分组

　　将大鼠随机分为3组：哮喘组，治疗组和对照组，每组大鼠各10只.

　　1.2.2模型建立

　　文献［2］的方法，用10 g/L OVA和10 g/L氢氧化铝溶液0.5 mL大鼠腹腔注射和0.5 mL前腿内侧皮下注射，第8日重复注射1次，至15 d开始吸入10 g/L OVA溶液激发5 min. 10 g/L 的OVA溶液需每日配制，雾化时将大鼠置于特制塑料容器内雾化吸人.治疗组在雾化激发后1 h给予椒目油和熟精油的混合物(按1：1混合)，以3 mL/kg灌胃.对照组以生理盐水代替OVA致敏和雾化.

　　1.2.3大鼠气管和支气管病理组织

　　观察3组大鼠在激发3 mo后处死并制作病理标本. 经右主支气管注入100 mL/L的中性甲醛溶液10 mL至肺适度膨胀，将右肺连同右主支气管剪下放入100 mL/L 中性甲醛固定7 d.从右侧下肺叶开口处以水平位取材，制成石蜡切片， 行HE染色作病理观察.HE染色切片放大100倍，选择R<0.2 mm，横断面完整的小支气管测量气道内周长(Pi)和最大直径上相对的两个管壁厚度(T1, T2)，计算(T1+T2)/Pi.

　　1.2.4免疫组化检测

　　PCNA和Ⅲ型胶原含量用ABC法，以PBS代替一抗作为空白对照,小鼠抗大鼠Ⅲ型胶原抗体工作浓度为1∶100.组织切片按序以PBS漂洗，300 mL/L羊血清，一抗、二抗孵育后浸入ABC液中1 h，取出经PBS，Tris? HCl缓冲液漂洗，再以DAB显色，苏木精复染，常规脱水，透明、封盖.每例标本取2张切片，每张切片随机选取直径在100～200 pm的小支气管5支，应用彩色图像分析系统测定黏膜下层吸光度确定Ⅲ型胶原的含量，以平均吸光度(A值)表示，取其平均值作为测定值.

　　统计学处理： 实验数据用x±s表示，应用SPSS 10.0软件进行t检验分析，P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1肺组织HE染色及嗜性粒细胞浸润

　　哮喘组大鼠肺切片HE染色可见支气管上皮细胞肿胀、脱落，管壁增厚，管腔变窄，管壁内及管周有大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主；治疗组大鼠的肺组织可见支气管上皮细胞的炎症反应较哮喘组为轻，支气管壁及管腔内的炎症细胞也大为减少；对照组大鼠的肺组织则无上述改变.

　　2.2大鼠支气管平滑肌厚度的变化

　　哮喘组(图1A)大鼠哮喘组大鼠气道壁厚度较对照组明显增加(P<0.05)，组(图1B)大鼠气道壁厚度较哮喘组明显降低(P<0.05)，但与对照组（图1C）相比仍较高(P<0.05，表1).表1Ⅲ型胶原在支气管肺组织的阳性表达及支气管平滑肌厚度的变化(略）

　　2.3Ⅲ型胶原的表达

　　各组动物气道及其周围肺组织均可见呈深棕色圆形颗粒的Ⅲ型胶原阳性反应细胞,主要分布在气道壁黏膜下层.

　　灰度分析结果显示哮喘组表达明显高于对照组，治疗组低于哮喘组略高于对照组(P<0.01，表1).

　　2.4PCNA表达的变化

　　各组动物气道及其周围肺组织均可见染色呈棕黑色圆形颗粒的PCNA蛋白阳性反应细胞.分布于上皮下基底膜、平滑肌细胞及外周成纤维细胞.哮喘组阳性细胞颗粒数目及灰度明显高于对照组(P<0.01)；治疗组明显低于哮喘组(P<0.01)，略高于对照组( P<0.01).

　　3讨论
 
　　气道重建又称气道重塑或重构［3］，它是哮喘病理特征之一，哮喘气道重建是一个集合性术语，特指哮喘患者气道壁结构的改变不同于正常气道组织学改变，在哮喘患者气道中除有炎症性细胞浸润外主要表现为上皮脱落，气道平滑肌层的增生、肥大以及基底膜增厚和玻璃样变. 气道重建是顽固性哮喘反复发病的基础，因此防止哮喘气道重建是目前国内外研究的一大热点.而目前评价任何一个治疗哮喘药物，除了它的平喘、止咳之外，还要评价它能否有防止哮喘气道重建的作用.
　　
　　哮喘气道重建的机制非常复杂，涉及到多种细胞、细胞因子及炎症介质等.在哮喘反复发作过程中，气道反复损伤和修复，由于各种致上皮损伤因素持续存在，引起损伤修复不平衡，导致气道重建. 其主要特征是平滑肌细胞增殖及细胞外基质沉积［4］. 细胞外基质沉积主要由胶原及少量纤连蛋白等构成［5］.细胞外基质中胶原的沉积主要为Ⅲ型、Ⅴ胶原的显著增生，其部位主要位于黏膜下层，基底层和肺间质中增加不明显，Ⅲ型胶原的增生成为细胞外基质沉积的主要病理基础［6］.气道重建是气道受到慢性炎症反复刺激的结果，可溶性生长因子、炎性因子等在其中发挥着重要作用，它们具有诱导成纤维细胞、气道平滑肌的有丝分裂作用，或促进结缔组织的合成.转化生长因子的表达与成纤维细胞数相关，并能增加气道平滑肌细胞DNA合成以促进细胞分裂增殖.
　　
　　PCNA是一种分子质量为36 ku的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白.PCNA表达仅见于增殖细胞且细胞周期密切相关，其表达量与DNA的合成一致，因此PCNA表达情况可作为评估组织中细胞增殖状态的一个可靠指标.

　　我们的结果发现，哮喘组支气管上皮细胞肿胀、脱落，管壁增厚，管腔变窄，管壁内及管周有大量炎性细胞浸润，以EOS和淋巴细胞为主；治疗组支气管上皮细胞的炎症反应较哮喘组为轻，支气管壁及管腔内的炎症细胞也大为减少；对照组则无上述改变. 免疫组化结果显示Ⅲ型胶原,PCNA的表达哮喘组明显高于对照组(P<0.01);治疗组低于哮喘组略高于对照组(P<0.01).说明早期服用椒目油不仅可以有效地治疗哮喘，而且可以有效地预防气道重建.

　　特有的中西医结合疗法针对哮喘“急则治标(西医解痉，中医降气)，缓则治本(补肾固本)”的方法，使哮喘患者获得较长时间的缓解期［7］.有许多关于椒目治疗哮喘的报道［8-9］大多数是从临床效果来说明，而缺乏药基础. 我们从抑制Ⅲ型胶原增生、基底膜增厚，降低PCNA、预防气道平滑肌肥大,从而低气道重建出发研究椒目油治疗哮喘的机制，通过研究其抑制Ⅲ型胶原增生达到预防基底膜增厚、减少PCNA,预防气道平滑肌肥大，为椒目治疗哮喘提供了药理学基础.

【】
  　　［1］潘金友，孟炎，陈孝伯，等. 椒目油丸治疗哮喘的疗效观察［J］.中药材，1999，29(2)：103-104.

　　［2］张韶君,杜永成,许建英. 致敏大鼠成肌纤维细胞与Ⅲ型、V型胶原表达关系的研究［J］. 山西医科大学学报,2003,34(2):0111-0113.

　　［3］戚好文. 哮喘气道重建支气管哮喘研究中所面临的挑战［J］. 第四军医大学学报, 2002,23(13):1153-1102.

　　［4］Redington AE．Fibrosis and airway remodeling［J］. Clin Exp Allergy, 2000，30(1)：42-45．

　　［5］Hoshino M, Nakmura Y, Sim JJ, et al.Expression of growth factors and remodeling of the airway wall in bronchial asthma［J］. Thorax, 1998,53:21-27.

　　［6］Holgate ST. Inflammation and structural changes in the airways of patients with asthma［J］．Respir Med, 2000,94:S3-S6.

　　［7］钟南山. 我国支气管哮喘防治研究重点及努力方向［J］.中华呼吸和结核杂志，2005,28(12):809-811.

　　［8］潘金友，孟炎，陈孝伯,等. 椒目油丸治疗哮喘的疗效观察［J］.中药材，1999,29(2):103-104.

　　［9］任周新，连中鄂，孟林. 椒目提取物止咳平喘作用的试验研究［J］.河南中医药学刊，1999,14(2):20-21.