线粒体相关疾病蛋白质组学研究进展

【关键词】  线粒体；疾病；蛋白质组学

　　【摘要】 作为后基因时代的一门新学科，蛋白质组学研究技术为线粒体蛋白质组的研究提供了有力的支持，使得从整体上研究线粒体蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能. 本文回顾了近年来国外学者应用蛋白质组学研究方法揭示相关疾病线粒体蛋白质存在相应的变化，以及通过对线粒体蛋白质组的研究去发现线粒体蛋白质在疾病发生中的作用，从而为寻找与疾病密切相关的疾病特异性蛋白提供线索.

　　【关键词】 线粒体；疾病；蛋白质组学

　　0引言

　　二十一世纪初，人类基因组计划基本完成. 生命研究步入了后基因时代，其核心便是蛋白质组研究. 蛋白质组被定义为：一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套的蛋白质. 这是一个整体的、动态的概念.而蛋白质组学是研究这些成分在指定时间或特定环境条件下的表达. 因为蛋白质是我们理解细胞功能和疾病过程的核心，如果在蛋白质组学方面没有共同的努力，基因组学的成果将不会成为现实. 蛋白质组学现在被认为是一个在诊断和发现伴随细胞器变化的复杂疾病的强有力的工具. 迅速发展的蛋白质组学也推动了线粒体蛋白质组的研究发展.
　　
　　近年来国外学者应用蛋白质组学研究方法揭示相关疾病线粒体蛋白质存在相应的变化，并通过对线粒体蛋白质组的研究去发现线粒体蛋白质在疾病发生发展中的作用，从而为寻找与疾病密切相关的疾病特异性蛋白提供线索. 现就近年来，相关疾病线粒体蛋白质组的研究进展作一综述.

　　1线粒体相关疾病蛋白质组学研究

　　线粒体是真核细胞中最复杂和最重要的细胞器之一，哺乳动物除成熟红细胞外，线粒体普遍存在于有氧呼吸的真核细胞的细胞质中. 它是细胞内的能量供应中心，与氧自由基生成有关. 线粒体在脂肪酸代谢、嘧啶生物合成、体内钙平衡，以及细胞信号传导中起着主要作用. 同时，线粒体也是人类“另一”个来源于母系基因组的所在地. 许多细胞进程,如凋亡、老化以及多种疾病病机制(包括癌、肌病、糖尿病、肥胖、老化、特别是神经退行性疾病等)都与线粒体功能障碍或突变有关［1-2］. 在人类线粒体中约有1500个蛋白质［3］，其中已经有600多种蛋白质被鉴定出来. 如果能鉴定出大部分，甚至全部蛋白质那将是非常宝贵的资源. 蛋白质组学技术为研究线粒体疾病和线粒体功能失调，为寻找疾病诊断的标志物，探索药物作用靶点提供了必不可少的手段. 成为临床、基础研究的热点.

　　1.1神经系统疾病

　　1.1.1神经退行性疾病帕金森病：是一种中老年人常见的运动障碍疾病，以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为病理特征［4］. 目前，导致黑质多巴胺能神经元变性缺失的确切发病机制尚不完全清楚，但是已经知道线粒体功能障碍在其中起了重要作用. 采用定量蛋白质组学技术和同位素编码标记物方法，Jin等［5］对使用1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶（MPTP）辅以二丙苯磺胺（probenecid）处理5 wk的慢性帕金森病小鼠和对照小鼠，进行了二组间黑质线粒体蛋白表达谱的差异表达比较. 辨别出超过300个蛋白点. 比较处理组和对照组中这些蛋白点，发现超过100个蛋白点在处理组中有量上的显著变化，经鉴定其中有一个蛋白质为：DJ1，它的突变与家族性帕金森病有关. 采用蛋白印记分析和免疫组化方法得出，其在黑质的分布与鼠细胞内包涵体形成有关. 包涵体如同帕金森患者中的路易小体. 这一结果说明DJ1不仅与α突触核蛋白同时聚集在多巴胺能神经元中，还存在于经MPTP/prob处理的小鼠细胞包涵体内. 这一结果表明：在线粒体功能缺陷和帕金森病患者路易小体的形成中，DJ1可能起了重要作用.

　　阿尔茨海默病：是老年人中常见的神经系统变性疾病. 日益增多的证据表明新陈代谢异常和氧化应激所致线粒体功能缺陷与阿尔茨海默病相关. David等［6］采用蛋白质组学技术对阿尔茨海默病的P301L Tau转基因小鼠的蛋白质表达谱进行分析发现，主要是与新陈代谢相关的蛋白：包括线粒体呼吸链复合物组成部分、抗氧化剂酶、突触蛋白等都有改变. 随后的功能分析提示，Tau蛋白和β淀粉样蛋白对线粒体损伤有协同作用.

　　1.1.2家族性肌萎缩侧索硬化症肌萎缩侧索硬化症是运动神经元疾病最常见的类型，肌萎缩侧索硬化症是一种致命的神经变性疾病，特征是运动神经元的不断死亡. 大约10%的肌萎缩侧索硬化症患者是家族遗传病例. 肌萎缩侧索硬症已被公认与铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn super oxide dismutase gene，SOD1）基因突变有关，其在家族性遗传性病例中占20%. 至今已有超过90种基因突变类型被发现. 不断积累的研究证据表明，在家族性肌萎缩侧索硬化症的病因学中线粒体功能障碍和细胞凋亡的激活起了重要作用. 但是很少知道哪个SOD1基因突变导致了线粒体功能障碍和细胞凋亡. 应用蛋白质组学方法，Fukada等［7］对NSC34细胞的G93ASOD1型所致的家族性肌萎缩侧索硬化症的线粒体蛋白质改变进行了研究. 采用两种独立的蛋白质组学方法，在线粒体断片中辨别出470个蛋白点，其中有75个是新发现的，这些蛋白以前只在cDNA水平报道过. 随后，他们采用2DPAGE方法分析了NSC34细胞野生型和NSC34细胞的G93ASOD1型的线粒体蛋白质组表达谱的区别. 在G93ASOD1型表达谱中，有9个点显示高表达，36个点低表达. 运用MS鉴定这45个点，这些蛋白点包含了有关线粒体膜转运、凋亡、呼吸链和分子伴侣蛋白等. 特别是发现，翻译后修饰的电压依赖性阴离子通道2蛋白的改变，该蛋白与线粒体膜渗透性的调节和细胞凋亡激活之间的关联正在激烈地讨论之中. 该研究所发现的这些线粒体蛋白，很可能是揭开SOD1突变导致线粒体功能障碍和细胞凋亡的钥匙.

　　1.1.3癫痫癫痫是一组由不同病因引起，脑部神经元高度同步化、且常具有自限性的异常放电所致疾病. 临床表现具有发作性、短暂性、重复性以及刻板性的中枢神经系统功能失常为特征的综合征. Kammer等［8］对点燃小鼠的脑组织采用2DE和质谱分析技术鉴定出了一种变异的Rieske铁硫蛋白（Rieske ironsulfur protein）. Rieske铁硫蛋白是线粒体复合物Ⅲ的一部分. 研究显示，在癫痫发作中Rieske蛋白可能对神经元的反应起一定作用，从而在癫痫的分子发病机制上提出了一种新见解.

　　1.2心脏病扩张型心肌病是一种严重的可导致心衰的心脏病. Knecht等［9］采用双向电泳（2DE，2D electrophoresis）取得了3300个心肌蛋白条带. 通过氨基酸序列分析、Edman降解法及基质辅助的激光解吸离子化质谱（matrixassisted laser desorption MALD mass spectrometry MS）等方法分析了其中150条带. 经活检及术后病理证实，其中有12条为扩张性心肌病特有的蛋白质. Arnott等对新福林诱导的肥大心肌细胞进行线粒体蛋白质组分析，与对照样品相比较发现有8种蛋白质的表达水平发生了不同程度的变化. 对存在缺血再灌注区、被预先处理的局部缺血兔心和正常兔心线粒体断片，Kim等［10］应用蛋白组学技术检测其蛋白表达水平的差异. 采用2DE，辨别出25个线粒体蛋白，在缺血再灌注心肌中出现了不同程度的表达. 鉴定出的大部分蛋白与线粒体呼吸链和能量代谢有关. 同时表明，要鉴定因缺血所致心肌损害的生物标志物，蛋白质组学技术为其提供了一个适当的手段.

　　1.3其他疾病

　　1.3.1乙醇依赖性肝损伤对暴露于慢性乙醇的动物模型，Venkatraman等［11］运用蛋白质组学方法进行了肝线粒体蛋白水平变化的分析，结果显示43个点出现不同水平的改变. 其中13个点上调而另30个点下降. 在这些蛋白中，以前并不知道的25个蛋白发生了改变. 研究结果表明，长期饮酒导致的线粒体蛋白质组的改变远远超过了人们的预先估计. 在长期乙醇喂养的小鼠线粒体中所有核和线粒体编码基因产物中的氧化磷酸化复合物均有下降，说明在整个代谢通路中存在合成障碍.

　　1.3.2肿瘤随着线粒体功能蛋白质组学研究的发展，已经有可能鉴定出癌细胞中线粒体蛋白表达的异常，并有可能鉴定出新产生的生物标记物，并以此来作为早期检测和进行风险评估的指标［12］. Herrmann等［13］采用蛋白组学技术定量分析了，线粒体编码细胞色素C氧化酶亚单位和核编码细胞色素C氧化酶亚单位的比率，发现该比率与前列腺组织恶性进程相关. 在从正常上皮组织通过癌前病变发展到浸润性癌的过程中，核编码细胞色素C氧化酶亚单位IV, Vb, Vic与线粒体编码细胞色素C氧化酶亚单位I 和 II 之间相对浓度的比率有很显著的变化. 显然这一改变发生在恶化的早期阶段，充分显示了核DNA编码的线粒体蛋白在致癌上起了作用，为寻找潜在的生物标志物提供了依据.

　　1.3.3内毒素血症内毒素休克导致的器官功能衰竭现在已经被认为与线粒体功能受损相关联. Miller等［14］运用2DE及MS技术，通过对存在脂多糖免疫反应的大鼠肝线粒体蛋白质和对照组进行比较，发现ATP合酶α链、超氧化物歧化酶有显著的增量调节. 这些结果提示，内毒素休克介导的线粒体蛋白组改变促进了代偿反应（适应内毒素休克），而不是细胞损伤所致. Crouser等［15］也对内毒素血症中线粒体蛋白质组变化作了研究. 采用经静脉注入内毒素（3.0 mg/kg），以成年雄性猫和未处理的猫作对照，经2DE发现两组动物的肝线粒体蛋白表达谱有14个点不同. 质谱分析表明鸟氨酸循环酶、热休克蛋白60、二氧化锰超氧化剂岐化酶高表达，而热休克蛋白70、F(1)ATP酶和调节脂质代谢的关键酶表达降低. 他们认为在内毒素血症中线粒体功能有明显改变.

　　1.4老化关于老化过程的信息可以通过认识蛋白表达的改变来获得. Kim等［16］用2DE方法，对13 mo（年幼）和31 mo（年老）大小的雄性Fischer344大鼠肾的线粒体断片进行了差别分析. 电泳图谱中检测出380个点，其中167个点二者比较有显著性差异，再通过应用基质辅助的激光解吸及电离时间飞行质谱鉴定了其中103个蛋白. 在年老的线粒体断片中显示出，抗氧化和蛋白水解的蛋白增多，细胞骨架蛋白减少. 他们认为：通过对蛋白表达的蛋白质组学分析，可有效的评估年龄状态. Kiri等［17］也做了类似实验，他们对3~8 mo（年幼）牛心和18~24 mo（成年）牛心线粒体运用蛋白质组学技术进行蛋白分离和鉴定. 在PH 5~8范围中选取鉴定40个蛋白点，40个点中有5个蛋白只存在于成年，而另有5个蛋白只存在于年幼的牛心，有8个蛋白的量在两组中比较至少相差2倍以上. 这些蛋白中有与能量生成、新陈代谢密切相关的酶，线粒体蛋白合成延伸酶等. 这些氧化修饰蛋白很可能与促成心脏蛋白年龄相关性退化和功能减退有关.

　　1.5毒研究为研究锰对线粒体的毒性，Zhang等［18］对经二氯化锰（30 mg/kg）处理的雄性斯普拉道来大鼠的脑的线粒体，应用考马斯蓝染色，2DPAGE分离出超过300个点在. 与对照组相比，有3个点被抑制，3个点被诱导. 通过MALDITOF鉴定了有ATP依赖钙离子泵、60 000热休克蛋白、线粒体跨膜鸟苷三磷酸酶FZO1B、长链脂肪酸CoA连接酶、ATP合酶β链、琥珀酸脱氢酶、黄素蛋白等. 这些结果表明线粒体呼吸链复合物的改变与二氯化锰诱导的线粒体机能障碍相关.

　　2展望

　　线粒体蛋白质组研究也必须克服一些困难：由于分离技术和鉴定技术的局限，低丰度、低分子量蛋白质及疏水性蛋白质难以鉴定. 数据库的贫乏，线粒体蛋白质组学还有待于更进一步的. 虽然线粒体蛋白组学在疾病中的应用还不是十分广泛，但是从发展趋势可以看出它的研究是值得期待的. 今后需进一步完善：① 线粒体蛋白组数据库，特别是人类线粒体蛋白组数据库的完善，以便将来与病变组织线粒体蛋白质表达谱进行比对. 建立一个详细全面的人类线粒体图谱数据库，有意义的线粒体蛋白功能得到确定，将会成为开发药物和探索疾病诊断的强大工具. ② 研究细胞内线粒体蛋白的相互作用和转运. 随着蛋白质组学技术的不断发展进步，线粒体蛋白质组也将得到长足发展，因此揭开线粒体作用机制不再是梦想，预防和线粒体相关疾病必将成为现实.

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　　［1］ McDonald TG, Van Eyk JE. Undercover in the lipid bilayer ［J］. Basic Res Cardiol, 2003,98(4):219-227.

　　［2］ Lopez MF, Melov S. Mitochondrial proteins and effect on functions ［J］. Circ Res, 2002, 90(4):380-389.

　　［3］ Taylor SW, Fahy E, Zhang B, et al. Characterization of the human heart mitochondrial proteome ［J］. Nat Biotechnol, 2003,21(3):281-286.

　　［4］ Braak H, Del Tredici K, Rub U, et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinsons disease ［J］. Neurobiol Aging, 2003,24(2):197-211.

　　［5］ Jin JH, Meredith, Gloria E, et al. Quantitative proteomic analysis of mitochondrial proteins: relevance to Lewy body formation and Parkinsons disease ［J］. Brain Res Mol Brain Res, 2005,134(1): 119-138.

　　［6］ David DC, Hauptmann S, Scherping I, et al. Proteomic and functional analyses reveal a mitochondrial dysfunction in P301L tau transgenic mice ［J］. J Biol Chem, 2005,280(25): 23802-23814.

　　［7］ Fukada K, Zhang FJ, Alexis Vien, et al. Mitochondrial proteomic analysis of a cell line model of familial amyotrophic lateral sclerosis ［J］. Mol Cell Proteomics, 2004,3(12):1211-1223.

　　［8］ Junker H, Spate K, Suofu Y, et al. Proteomic identification of the involvement of the mitochondrial rieske protein in epilepsy ［J］. Epilepsia, 2005,46(3):339-343.

　　［9］ Knecht H, Odermatt BF. Rearranged epsteinbarr virus genome in Hodgkins disease and angioimmunoblastic lymphadenopathy: Swiss results ［J］. Am J Pathol, 2003, 163(1):369-370.

　　［10］ Kim N, Lee Y, Kim H, et al. Potential biomarkers for ischemic heart damage identified in          mitochondrial proteins by comparative proteomics ［J］. Proteomics, 2006,6 (4):1237-1249.

　　［11］ Venkatraman A, Landar A, Ashley J, et al. Modification of the mitochondrial proteome in response to the stress of ethanoldependent hepatotoxicity ［J］. J Biol Chem, 2004,279(21):22092-22101.

　　［12］ Verma M, Kagan J, Sidransky D, et al. Proteomic analysis of cancercell mitochondria ［J］. Nat Rev Cancer, 2003, 3(10): 789-795.

　　［13］ Herrmann PC, Gillespie JW, Charboneau L, et al. Mitochondrial proteome: Altered cytochrome c oxidase subunit levels in prostate cancer ［J］ . Proteomics, 2003, 3(9):1801-1810.

　　［14］ Miller I, Gemeiner M, Gesslbauer B, et al. Proteome analysis of rat liver mitochondria reveals a possible compensatory  response to endotoxic shock ［J］. FEBS Lett, 2006,580(5):1257-1262.

　　［15］ Crouser ED, Julian MW, Huff JE, et al. A proteomic analysis of liver mitochondria during acute endotoxemia ［J］. Intensive Care Med, 2006, 32(8):1252-1262.

　　［16］ Kim CH, Park DU, Chung AS, et al. Proteomic analysis of postmitochondrial fractions of young and old rat kidney ［J］. Exp Gerontol, 2004,39(8): 1155-1168.

　　［17］ Ajay NK, HungCuong T, Kate L, et al. Proteomic changes in bovine heart mitochondria with age: Using a novel technique for organelle    separation and enrichment ［J］. J Biomol Tech,2005,16(4):369-377.

　　［18］ Zhang S, Fu J, Zhou Z, et al. In the brain mitochondrial proteome of male SpargueDawley rats treated with manganese chloride ［J］. Toxicol Appl Pharmacol,2005,202(1): 13-17.