甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用
作者：张建军 李洪源 王吉锡 李鑫 朴英爱 陈振华 谢志平 杨庆伟
【摘要】 目的 研究甘草抗病毒活性成分(GX)体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法 采用中性红实验和观察细胞病变(CPE)法，以利巴韦林为阳性药,测定GX对RSV的抑制作用。结果 GX的半数中毒浓度（TC50）为460.00?μg/ml，半数有效抑制浓度(EC50)为23.53?μg/ml，指数(TI)为19.55;GX在RSV感染Hela细胞2，4，6，8，10?h后给药, 对RSV复制均有明显的抑制作用(P<0.01)；且GX对RSV有中和作用。结论 GX在体外对RSV复制有明显的抑制作用。
【关键词】 甘草；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用
呼吸道合胞病毒（RSV）是一个世界范围内婴幼儿最常见的呼吸道感染的病原体。目前，对RSV的防治仍无有效的疫苗和药物〔1〕。近年来，国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药开发的一个热点〔2〕。本课题组在2004年报道甘草水提液具有明显的抗RSV的作用；在2005年发现甘草有效部位GC3?1?4具有抗RSV的作用基础上〔3〕,进一步分离到抗病毒活性成分（GX），并在细胞水平上检测其抗RSV的作用。现将结果报告如下。
1 对象与方法
1?1 材料
甘草(产地内蒙古，经黑龙江省药品检验中药研究所鉴定)。利巴韦林注射液(天津药业集团新郑股份有限公司,批号：0610152)。人宫颈癌传代细胞(Hela),(疾病预防控制中心病毒研究所)。呼吸道合胞病毒(RSV-Long株)(中国疾病预防控制中心病毒研究所)。RSV在Hela细胞中的组织半数感染量(TCID50)为1×10-6.6/0.2?ml。本次实验采用100TCID50/0.2?ml的感染量。硅胶制备板(安徽良臣硅源材料厂)。甲醇、三氯甲烷、无水乙醇等，均为分析纯(天津市博迪化工有限公司)。中性红(上海华舜生物工程有限公司)，用磷酸盐缓冲液稀释。脱色液：由无水乙醇、枸橼酸钠和盐酸组成。
1?2 方法
1?2?1 甘草抗病毒活性成分（GX）的制备
甘草经水煎煮浸提、醇沉、大孔吸附树脂柱层析得到的GC3?1?4,再经由氯仿和甲醇组成的展开剂，在硅胶板上经薄层层析得GX。
1?2?2 药物毒性实验
用细胞维持液将GX和利巴韦林释为7个浓度组，分别加入到Hela细胞已长成单层的96孔培养板上。同时设正常细胞对照组。置35℃、5% CO2培养箱培养3?d后，弃去维持液,每孔添加0.2?ml中性红染液,放回培养箱培养2?h。取出后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次,添加0.2?ml脱色液。室温暗处放置30?min后,酶标仪450?nm波长下测吸光度(A)值〔4〕，测定细胞存活率，求药物半数中毒浓度(TC50)。细胞存活率=药物组平均A值/细胞对照组平均A值×100%。
1?2?3 药物抗RSV实验
参照〔5〕。实验分3组进行。(1)药物的抑制作用：在96孔板上，接种100TCID50/0.2?ml RSV液，0.2?ml/孔。吸附2?h后，分别加入不同浓度的GX和利巴韦林。置培养箱中培养。同时设正常细胞对照组和病毒对照组，待病毒对照组细胞病变(CPE)为4时，中性红实验同上,测定病毒抑制率，求药物的半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。病毒抑制率=［实验组(药物+病毒)平均A值-病毒对照组平均A值］/［正常细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值］×100%。CPE记录规则：0为细胞无CPE；1为0～25% CPE；2为25%～50% CPE；3为50%～75% CPE；4为75%～100% CPE。TI=TC50/EC50。(2)不同时间给药对RSV抑制作用：向96孔板中，加入100TCID50/0.2?ml RSV液，0.2?ml/孔，分别作用2，4，6，8，10，12?h后吸弃病毒液，再分别加入GX（浓度为120.00?μg/ml）和利巴韦林（浓度为80.00?μg/ml），培养方法同上。待病毒对照组CPE为4时，记录CPE结果。(3)药物的中和作用：200TCID50/0.2?ml RSV液与含不同浓度药物的维持液等体积混合，35℃作用2?h后,加到96孔板中，0.2?ml/孔。吸附2?h，弃上清，加细胞维持液，置培养箱中培养。待病毒对照组CPE为4时，记录CPE结果。
1?3 统计分析
采用SAS?8?2软件进行分析。利用Reed?Muench法测定病毒TCID50，Logit回归药物TC50和EC50〔6〕。不同时间处理组或不同剂量组与病毒对照组之间的结果比较采用Kruskal-Wallis法。
2 结 果
2?1 药物毒性结果测定
根据中性红实验测定细胞存活率，Logit回归得GX的TC50为460.00?μg/ml，利巴韦林的TC50为1.01?mg/ml。
2?2 药物对细胞内RSV抑制作用(表1) 表1 GX和利巴韦林对RSV的抑制作用GX浓度(略)
经Logit回归方法计算得GX的EC50为23.53?μg/ml，利巴韦林的EC50为12.90?μg/ml。所以GX的TI为19.55，利巴韦林的TI为78.29；GX在一定浓度时对RSV在Hela细胞内的复制有明显的抑制作用。
2?3 不同时间给药对RSV抑制作用
Kruskal-Wallis检验结果表明，在RSV感染2，4，6，8，10?h后给药，GX和利巴韦林组细胞病变(CPE)程度均低于病毒对照组，且差异有统计学意义(P<0?01)，说明在RSV感染2，4，6，8，10?h后给药，GX仍具有抑制RSV在Hela细胞内复制的作用。
2?4 药物对RSV的中和作用(表2)表2 GX和利巴韦林对RSV中和作用（略）注：* P<0.01
GX15?55?μg/ml及以上各药物浓度组CPE程度均低于病毒对照组CPE,差异有统计学意义(P<0?01)；利巴韦林10?37?μg/ml及以上各药物浓度组CPE程度也低于病毒对照组CPE，差异也有统计学意义(P<0?01)。说明GX在一定浓度时，对病毒有较好的直接灭活作用。
3 讨 论
本实验用抗病毒活性作为导向分离方法从甘草中分离到抗病毒成分GX。为了验证GX抗RSV的作用，实验中RSV病毒感染量定为100TCID50/0?2?ml，并设立了严格对照组(正常细胞对照，病毒对照和阳性药物对照)。结果表明GX对RSV复制有明显的抑制效果，其EC50为23?53?μg/ml，TI为19?55。结果也表明，GX抗RSV作用是多途径的，不仅有直接灭活病毒的作用，而且对于进入细胞的病毒，无论是在病毒复制的早期，还是在病毒复制的中晚期，均有一定的抑制作用。
目前，大多数研究认为甘草中有抗病毒作用的主要成分是甘草酸〔7〕和甘草多糖〔8〕。实验中，初步验证GX不是甘草酸和甘草多糖，可能是一种新的抗病毒物质，因此，应对GX化学结构进行深入研究。体外研究不能充分体现药物在体内的生化转化效应,本实验有待于在动物体内检验其抗RSV的作用；GX是通过抑制病毒核酸复制,还是通过阻止病毒蛋白合成，而实现对RSV复制的抑制，其具体作用机制尚需研究。
【】
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