霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体基因组结构研究

【关键词】  霍乱弧菌；噬菌体；序列分析,

　　摘要：目的   研究霍乱弧菌埃尔托型（EVC）新类型溶源性噬菌体（CTXφ）和核心区不含ctxAB基因的溶源性噬菌体（nct-CTXφ）基因组的结构。方法   采用基因扩增、测序及序列生物信息学等方法进行观察与分析。结果   在我国EVC中，存在仅携带古典型（class）nct-CTXφ、CTXφ或埃尔托型（ET）CTXφ基因组类型，并发现nct-CTXclassφ和CTXETφ共存、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ共存的新类型。CTXφ和nct-CTXφ基因组zot基因3′末端，60bp序列中40%位点不同，推测的氨基酸序列中60%位点不同。class、ET和newET类型ig1、rstR和ig2基因序列同源性分别为770%～974%，104%～179%，96%～648%，RstR同源性92%～241%。CTXφ基因组均位于染色体TLC基因簇附近。上述不同类型EVC的tcpA、TcpA、ctxA、ctxB、CtxA和CtxB与GenBank中EVC和O139群产毒株的同源性分别>99%，99%，99%，98%，98%和96%。结论   首次在EVC中发现nct-CTXclassφ和CTXETφ、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ共存的新类型。

　　关键词：霍乱弧菌；噬菌体；序列分析

　　Study on structures of new types of CTXφ and nct-CTXφ genomes  

　　Abstract：Objective   To study on structures of new types of CTXφ and nct-CTXφ genomes of EI Tor biotype vibrio cholerae.Methods   PCR,sequencing and sequence analysis were conducted.Results   Only nct-CTXclassφ,CTXclassφ,or CTXETφ genome type,nct-CTXclassφ and CTXETφ,nct-CTXnewETφ and CTXclassφ genomes coexisted types in EI Tor strains isolated from China were found.Different rates of last 60 bp of zot gene and Zot of CTXφ and nct-CTXφ were 40% and 60%.Identities of ig1,rstR,ig2 gene and RstR of class、ET and newET types were 77.0%～97.4%,10.4%～17.9%,9.6%～64.8%,and 9.2%～24.1% differentially.Different types of CTXφ genome were found near TLC cluster.Identities of tcpA,TcpA,ctxA,ctxB,CtxA,and CtxB of strains in this study with others toxic EVC and O139 VC were over 99%,99%,99%,98%,98%,and 96%.Conclusion   nct-CTXclassφ and CTXETφ,nct-CTXnewETφ and CTXclassφ genomes coexisted types in EI Tor were found first.

　　Key words：vibrio cholerae;phage ;sequence analysis
     
　　霍乱弧菌(VC)的溶源性噬菌体（CTXφ）与新类型霍乱病原菌的产生密切相关，CTXφ基因组包括RS区和核心区。RS区依次包括ig1间隔区、rstR、ig2间隔区、rstA、rstB和rstC基因。其中主要变异基因为抑制子基因（rstR）及ig2，国外已报道了3种类型，分别发现于O1群霍乱弧菌古典生物型（CVC）、埃尔托生物型（EVC）和O139群VC，GenBank序列号分别为VCU83796、AF055890、AF110029，本文暂时命名为古典型（class）、埃尔托型（ET）和加尔各答型（calc）〔1- 5〕。核心区依次包括cep、orfU、ace、zot和ctxAB基因，核心区不携带ctxAB基因的CTXφ称为nct-CTXφ。本课题在研究我国EVC的CTXφ和nct-CTXφ基因组分布特征时，发现1种新类型rstR-ig2基因，暂命名为newET类型，还发现不同类型rstR-ig2基因的CTXφ和nct-CTXφ基因组共存的新类型。现将结果报告如下。

　　1   材料与方法

　　11   材料  

　　111   菌株   霍乱弧菌EVC（疾病预防控制中心），其中携带rstR-ig2基因的类型及菌株数分别为class 10株，ET 10株，class 和ET共存10株，class和newET共存4株。对共存类型利用ctxAB和zot基因探针Southern杂交，zot基因的拷贝数均多于ctxAB，表明这些菌株同时携带不同rstR-ig2类型的CTXφ和nct-CTXφ基因组。

　　112   主要试剂和仪器   Taq DNA 聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶（中国华美生物工程公司）；Gene Amp PCR system 9600型PCR扩增仪（美国PE公司）；GDS7500型凝胶成像仪(英国UVP公司)。

　　12   方法  

　　121   引物设计   利用Oligo60软件进行引物设计，引物在上海生工公司合成。扩增片断分别为：（1）上游引物CTRS上5′-ATT GAC AGG ATG AAG GAT ACC-3′，下游引物rstA下5′-CGG AAT TCT CGA CAT CAA ATG GCA TG -3′，用于扩增CTXφ基因组串联体的第1个基因组末端和第2个起始端之间的基因，扩增片断简称为CR，约1500bp，片段包括ctxB 3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。（2）上游引物ZCT上5′- GCT ACA AGG TGC TAC CGT TAC -3′，和引物rstA下配对，用于扩增nct-CTXφ基因组串联体的第一个基因组末端和第2个起始端之间的基因，扩增片断简称为ZR，约1500bp，包括zot 3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。对CR和ZR扩增产物进行酶切鉴定，内切酶选用RsaI和BglII。（3）上游引物TLC上5′-CTT GGA TTA AGT CAA CCA GAG -3′，和引物rstA下配对，扩增片断简称为TR，约20kb，包括TLC基因簇3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。对扩增产物进行酶切鉴定，内切酶选用RsaI和BglII。（4）ctxAB基因分段扩增：利用ZCT上和ZCT下5′- GTG TGT TGT GGT ATT CTG CAC -3′，引物CTB上5′- GGT GTA AAA TTC CTT GAC G -3′和CTB下5′- GCT TCT CAT CAT CGA ACC -3′扩增，扩增片段分别约1000和550bp。（5）tcpA基因扩增：引物tcpA上为5′- AGA ACA CGA TAA GAA AAC CG -3′和tcpA下5′- AAC GCT GGA TTT GAG ATG AC -3′，扩增片段约900bp。

　　122   PCR扩增及酶切   PCR反应体积50μl，1×PCR缓冲液，100μmol dNTP，05μmol引物，10 U Taq DNA聚合酶，模板约100ng（采用SDS裂解-酚氯仿抽提-乙醇沉淀方法制备）。PCR扩增的循环参数为：94℃ 5min；94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s～2min，30个循环；72℃ 5min。扩增产物在10%的琼脂糖凝胶上（含05μg/ml 溴乙锭）电泳，长波紫外线下观察并将PCR产物条带割下，利用试剂盒回收凝胶中PCR产物，回收的PCR产物直接作为测序模板。直接对PCR产物进行酶切，按内切酶试剂盒说明书操作，酶切产物同上电泳，紫外灯下观察并拍照。

　　123   PCR产物测序及序列分析   提供PCR扩增产物和扩增用引物作为测序引物，由上海博亚公司测序，对PCR产物直接测序。序列拼接及生物信息学分析应用DNAStar软件分析，网上同源比较应用http://wwwncbinlmnihgov网站BLASTn序列分析软件。

　　2   结果

　　21   CR和ZR基因扩增产物酶切及测序结果（图1，图2）   图1可见，扩增双拷贝nct-CTXφ基因组的ZR产物经酶切分析共分为2种类型，经测序表明rstR-ig2分别为class和newET类型，测序菌株分别为86015株和JX94484株。扩增双拷贝CTXφ基因组的CR产物经酶切分析共分为2种类型，经测序表明rstR-ig2分别为ET和class类型，测序菌株分别为S2株和S73株。

　　1：DL2000 DNA Marker；2：ZR86015；3：JX94484；4：CRS2；5：CRS73

　　图1   ZR和CR的PCR产物RsaI酶切图谱（略）

　　1：DL2000 DNA Marker；2：ZR86015；3：JX94484；4：CRS2；5：CRS73

　　图2   ZR和CR的PCR产物BglII酶切图谱（略）
     
　　图2可见，ZR和CR扩增产物测序结果表明：CTXφ和nct-CTXφ基因组zot基因3′末端60bp序列中40%位点不同，推测的氨基酸序列中60%位点不同；nct-CTXφ基因组在zot基因终止密码子后12bp处为ER序列，其后为ig1序列，无CTXφ基因组zot和ctxA基因之间的序列；class、ET和newET类型ig1、rstR和ig2基因序列同源性分别为770%～974%，104%～179%，96%～648%，rstR推测的氨基酸序列同源性为92%～241%。

　　22   TR基因扩增、酶切及测序(图3)   携带CTXφ和/或nct-CTXφ基因组的EVC，TR基因扩增均阳性，经RsaI和BgⅢ酶切共分为2个类型。测序表明，rstR-ig2基因分别为ET和class类型，测序菌株分别为SC8511和SC9773。

　　1：DL2000 DNA Marker；2，4和6模板为SC8511，分别为TR基因PCR产物及BgⅢ和RsaI酶切产物；3，5和7模板为SC9773，分别为TR基因PCR产物及BgⅢ和RsaI酶切产物

　　图3   TR基因PCR扩增及酶切图谱（略）

　　23   ctxAB基因测序结果   对SC9773株、SC8511、SC94118株和SC98107株的ctxAB基因分段扩增及测序，测序结果与标准菌株N16961的ctxA和ctxB基因的同源性分别>99%和98%，推测的氨基酸序列的同源性分别>98%和96%。

　　24   tcpA基因测序结果   对SD86015、SC9773株、SC8511、SC94118株和SC98107株的tcpA基因测序，tcpA基因及推测的TcpA氨基酸序列，与GenBank中查询到的EVC和O139群产毒株的同源性均>99%。

　　25   GenBank收录基因序列号   本研究被GenBank收录的基因序列号分别为:AF511006，AF511007，AF511008，AF521415，AF12401，AF510996，AF510994，AF510995，AF516343，AF511000，AF510999，AF511003。

　　3   讨论

　　将上述研究结果与本课题组已完成的分子流行病学资料〔6〕结合分析。结果表明， 不同rstR-ig2类型（以上标形式表示）的CTXφ和/或nct-CTXφ基因组及代表菌株分别为：携带nct-CTXclassφ基因组的SD86015株、携带CTXclassφ基因组的SC9773株、携带CTXETφ基因组的SC8511、同时携带nct-CTXclassφ和CTXETφ基因组的SC94118株、同时携带nct-CTXnewETφ和CTXclassφ基因组的SC98107株，后2种共存类型为国内外首次发现〔7,8〕。tcpA基因编码的TcpA组装的TCP菌毛是CTXφ感染霍乱弧菌的受体，本研究发现共存类型的tcpA基因序列同EVC标准菌株N16961株均100%同源，提示nct-CTXclassφ、CTXETφ、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ均可能以该类型TCP菌毛为受体而感染霍乱弧菌〔9〕。对CTXφ和/或nct-CTXφ基因组在染色体插入位点附近序列分析显示，CTXETφ和CTXclassφ基因组均与TLC基因簇相邻，除SD86015株nct-CTXclassφ基因组与TLC基因簇相邻，其他菌株的nct-CTXclassφ和nct-CTXnewETφ附近染色体序列均不是TLC基因簇，是何种基因有待进一步研究〔5〕。RS区的ig 2间隔区包括rstR基因的启动子和rstA的操纵区，RstR与rstA的操纵区结合并抑制rstA基因表达，RstR是rstA型特异性抑制子，也决定了噬菌体免疫性，即携带某一类型rstR基因的VC不再感染同类型的CTXφ或nct-CTXφ。class、ET和newET类型rstR-ig2基因及RstR序列同源性均非常低，这也是不同rstR-ig2类型nct-CTXφ和CTXφ基因组共存于同一菌株的理论基础。霍乱弧菌只要携带CTXφ基因组即可产生霍乱毒素，导致霍乱样腹泻，为什么部分菌株同时携带不同rstR-ig2类型的nct-CTXφ基因组，共存的意义也有待进一步研究〔3〕。

　　〔1〕   Sack DA,Sack RB,Nair GB,et al.Cholera［J］.Lancet,2004,363(9404):223-233.

　　〔2〕   Liu G,Yan M,Liang W,et al.Resistance of the cholera vaccine candidate IEM108 against CTXPhi infection［J］. Vaccine,2006,24(11):1749-1755.

　　〔3〕   Jensen MA,Faruque SM,Mekalanos JJ,et al.Modeling the role of bacteriophage in the control of cholera outbreaks［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(12):4652-4657.

　　〔4〕   McLeod SM,Kimsey HH,Davis BM,et al.CTXphi and Vibrio cholerae:exploring a newly recognized type of phage-host cell relationship［J］.Mol Microbiol,2005,57(2):347-356.

　　〔5〕   Bhattacharya T,Chatterjee S,Maiti D,et al.Molecular analysis of the rstR and orfU genes of the CTX prophages integrated in the small chromosomes of environmental vibrio cholerae non-O1,non-O139 strains［J］.Environ Microbiol,2006,8(3):526-634.

　　〔6〕   芮勇宇,阚飙,高守一,等.霍乱弧菌CTXφ基因组抑制子基因多态性分析［J］.预防医学杂志,2003,12(4增刊):211-213.

　　〔7〕   Sen A,Ghosh AN.New Vibrio cholerae O1 biotype El Tor bacteriophages〔J〕.J Virol,2005,2:28.

　　〔8〕   Nusrin S,Khan GY,Bhuiyan NA,et al.Diverse CTX phages among toxigenic vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic in Bangladesh［J］.J Clin Microbiol,2004,42(12):5854-5856.

　　〔9〕   Asaduzzaman M,Ryan ET,John M,et al.The major subunit of the toxin-coregulated pilus TcpA induces mucosal and systemic immunoglobulin A immune responses in patients with cholera caused by vibrio cholerae O1 and O139［J］.Infect Immun,2004,72(8):4448-4454.