苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究

【摘要】  目的 探讨苏云金芽孢杆菌（Bt)与蜡状芽孢杆菌（Bc）的亲缘关系,为Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供依据。方法 采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR（ERIC-PCR）技术，对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增，对其指纹图谱进行分析；回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段，以其为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果 与蜡状芽孢杆菌相比，苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致；所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250bp左右的片段；苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段。此外，以苏云金芽孢杆菌500bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论 肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系；500bp片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。

【关键词】  苏云金芽孢杆菌

　　苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis,Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为界中广泛分布的革兰阳性菌〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此，被作为生物杀虫剂广泛应用于农业及卫生害虫的生物防治；Bc则是人畜条件致病菌，可导致人食物中毒和感染，引起呕吐和腹泻〔2〕。研究表明，在自然环境中，两者染色体体外遗传物质可以出现高度重组〔3〕，在DNA水平也具有较高的同源性，只有个别碱基有差异〔4〕。由于Bt与Bc的相似性，许多细菌分类学家认为Bt与Bc应为同一个种〔5〕。Bt和Bc间的同源性关系，使Bt安全性问题越来越受到人们重视。因此，为研究两者的亲缘关系，对Bt的鉴定、Bt应用的安全性评价，以及进一步提高Bt杀虫效力、降低其致病风险，本文利用肠杆菌基因间重复一致序列（ERIC）－PCR技术〔6〕对Bt和Bc全基因组DNA进行扩增，对获得的Bt和Bc基因组DNA指纹图谱进行分析，探讨Bt和Bc起源进化关系，同时筛选并克隆了Bt基因组DNA扩增片段，对应用ERIC-PCR技术鉴别、鉴定Bt和Bc进行可行性探讨。结果报告如下。

　　1   材料与方法

　　1?1   材料

　　1?1?1   菌株   Bt 6株（菌株号为CGMCC 1?1749、CGMCC 1?1754、CGMCC 1?294、CGMCC 1?905、CGMCC 1?989、CGMCC 1?1014），Bc标准株1株（菌株号为CGMCC 1?126），大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等对照菌株各1株（菌株号分别为CGMCC 1?90、CGMCC 1?933和CGMCC 1?89）〔购于普通微生物菌种保藏中心（CGMCC)〕，Bc分离株2株为沈阳出入境检验检疫局分离,并经国标生化鉴定。

　　1?1?2   PCR引物及试剂   (1)ERIC引物: 由大连TaKaRa生物工程有限公司合成，引物序列分别为： PrimerⅠ：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，PrimerⅡ：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；（2）试剂：Ex-Taq酶、IPTG、X-gal（大连TaKaRa生物工程有限公司）；pGEM－T vector连接转化试剂盒（pGEM-T vectorSystem Ⅱ）及JM109高效率感受态细胞（美国Promega公司）；放射性同位素〔α-32P〕-dCTP和随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling System，英国Biolabs公司）；尼龙膜及3MM滤纸（英国Whatman公司）；其他试剂为本实验室自配，均为分析纯。

　　1?2   方法

　　1?2?1   菌株培养及其基因组DNA的提取   斜面活化的菌株在LB 培养基中30℃摇床培养过液(200r/min) ,离心收集2ml 培养的菌体(4000r/min ,10min ,20℃) ,采用实验室常规酚/氯仿法提取各菌株基因组DNA。所提取DNA经Beckman DU～640检测，吸光度A260/A280值在1?8～1?9之间，纯度符合PCR扩增条件。
　　
　　1?2?2   ERIC-PCR反应条件及结果鉴定   (1)反应体系组成和反应条件:依据方法〔7〕。PCR产物进行1?5％琼脂糖凝胶电泳（U＝3V/cm；T＝100min）。DNA标准分子量为DL2000，PCR产物经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上照相。

　　1?2?3   PCR产物回收与克隆   将上述扩增产物利用1?5%琼脂糖凝胶电泳分离。选取重复性好的Bt基因组DNA扩增片段，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。纯化产物连于pGEM-T载体，转入JM109感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行；阳性克隆子用NaOH/SDS碱裂解法制备质粒DNA。

　　1?2?4   斑点杂交   按照随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling System）说明标记回收产物，以标记产物为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。

　　1?2?5   引物设计及PCR验证   发生特异性杂交反应的克隆片段由大连TaKaRa生物工程有限公司进行测序。利用Primer Premier 5?0软件〔8〕,根据特异克隆片段序列信息设计引物，序列分别为:BthⅠ：5′?CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′BthⅡ:5′?TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物对应的扩增产物长度为363bp；PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30循环；72℃延伸5min。体系同ERIC?PCR。以6株Bt及其他对照菌株的染色体DNA作为模板，进行PCR反应。

　　2   结果

　　2?1   ERIC-PCR图谱（图1）   6株苏云金芽孢杆菌和3株腊状芽孢杆菌的基因组DNA经ERIC-PCR扩增，均可产生清晰的DNA指纹图谱，扩增片段范围100～2500bp，各菌株扩增图谱的多态性程度不同。Bt基因组DNA指纹图谱较一致，由3条主带构成，所有供试Bt菌株均有1条250bp左右的扩增片段，而蜡状芽孢杆菌间DNA指纹图谱变异较大。另外，Bt和Bc均可扩增得到600bp左右的共有片段。
     
　　1：CGMCC 1?1749； 2：CGMCC 1?1754； 3：CGMCC 1?294　4：CGMCC 1?905； 5：CGMCC 1?989； 6：CGMCC 1?1846　7：CGMCC 1?126； 8,9：Bc分离株 B：negative control-no DNA　M：DL2000

　　图1   Bt、Bc基因组DNA ERIC－PCR结果指纹图谱（略）

　　2?2   斑点杂交（图2）   纯化、克隆指纹图谱中稳定出现的Bt DNA扩增片段，经DU-640测定浓度约为90μg/L，以其为探针对固定于膜上的供试菌株基因组DNA进行斑点杂交。结果显示，以500bp片段为探针，与苏云金芽孢杆菌杂交结果为阳性，枯草芽孢杆菌及属外的各菌株杂交结果为阴性。

　　2?3   PCR验证（图3）   根据特异克隆片段序列设计的BthⅠ和BthⅡ引物对，可以从Bt菌的基因组DNA中扩增出约360bp的片段，符合预期结果；而所有对照菌株均没有扩增条带，表明此特异片段来源于Bt菌基因组DNA。1～6：Bt菌株；7,8,9：Bc 菌株；10：枯草芽孢杆菌；11：大肠埃希菌；12：金黄色葡萄球菌

　　图2   500bp探针对各菌株杂交放射性自显影1?5d照片（略）

　　1～6：Bt菌株；7,8：Bc菌株； 9：大肠埃希菌

　　图3   引物BthⅠ和BthⅡ对Bt菌及对照菌DNA的扩增结果（略）

　　3   讨论

　　根据本研究得到的Bt指纹图谱的保守性和Bc指纹图谱的变异性可以推测出，Bt在进化过程中出现较晚，这与Carlson等的Bt可能是获得携有cry基因质粒的Bc变种的观点相符〔9〕。从本实验的扩增图谱中还可看出,Bt亚种tolworthi HD125与其他Bt菌株的主带型一致，这一结果与Carlson 和 Kolsto关于肠毒素基因阴性Bt菌株起源的观点一致，即Bc获得cry基因后，进化为肠毒素基因阳性Bt菌株，然后失去该基因进化为肠毒素基因阴性Bt菌株〔10〕。另外，Bt与Bc均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段，体现了二者在遗传上的高度同源性。因此，ERIC指纹图谱可以正确反映出Bt与Bc的亲缘关系。由于Bt和Bc间的同源性关系，Bt安全性问题越来越受到人们重视〔11，12〕。本研究筛选到的500bp片段可作为苏云金芽孢杆菌的鉴定用探针。

【】
  　　〔1〕 David A Rasko,Michael R Altherr,Cliff S Han,et al.Genomics of the bacillus cereus group of organisms［J］.FEMS Microbiology Reviews,2005,29:303-329.

　　〔2〕 Lund T,Granum P E,Sullivan K O.The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from bacillus cereus［J］.FEMS Microbiol Lett,1999,178:355-361.

　　〔3〕 袁志明，蔡全信，Andrup L，et al.苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测［J］.微生物学报，2001，41（2）:148-154.

　　〔4〕 M C te Giffel,R R Beumer,N Klijn,et al.Discrimination between bacillus cereus and bacillus thuringiensis using specific DNA probes based on variable regions of 16S rRNA［J］.FEMS Microbiology Letters,1997,146:47-51.

　　〔5〕 Sergei G Bavykin,Yuri P Lysov,Vladimir Zakhariev,et al.Use of 16S rRNA,23S rRNA and gyrB gene sequence analysis to determine phylo-genetic relationships of bacillus cereus group microorganisms［J］.Journal Of Clinical Microbiology,2004,8:3711-3730.

　　〔6〕 金莉莉，王秋雨.ERIC-PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌［J］.公共卫生，2003,19(7): 879.

　　〔7〕 金莉莉，王秋雨，侯萧.ERIC-PCR技术在李斯特氏菌种、菌株鉴定中的应用［J］.遗传，2003，25（2）：195-197.

　　〔8〕 赵雨杰.医学生物信息学［M］.北京：人民军医出版社,2002：170-175.

　　〔9〕 Carlson,C R Caugant D A,et al.Genotypic diversity among Bacillus thuringiensis strains［J］.Appl Environ Microbiol,1994,60:1719-1725.

　　〔10〕 Sin-ichiro A,Yuki N,Hisanori B,et al.Takashi Y.Cloning of novel enterotoxin genes from bacillus cereus and bacillus thuringiensis［J］.Applied and Environmental Microbiology,1997,1054-1057.

　　〔11〕 Granum PE,O'Sullivan K,Lund T.The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from bacillus cereus［J］.FEMS Microbiol Lett,1999,178:225-229.

　　〔12〕 Bernstein L,Bernstein J A,Miller M,et al.Immune responses in farm workers after exposure to bacillus thuringiensis pesticides［J］.Environmental Health Perspectives,1999,107:575-582.