铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型影响

【摘要】  目的 通过研究慢性铝暴露大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型（PKCγ)的蛋白和mRNA表达的变化，观察大鼠海马CA1区长时程增强（LTP)形成，探讨铝暴露对学习记忆机制的影响。方法 选择断乳后Wistar大鼠，以含有不同浓度A1Cl3的水进行饲养。3个月后,测量大鼠海马LTP，用改良的Takai法测定PKC活性的变化，蛋白印迹（Western blotting)法检测PKCγ的蛋白表达；RT-PCR检测PKCγ的mRNA表达。结果 (1)各染铝组PKC活性与对照组比较均降低，差异有统计学意义（P<0?01)；(2)各染铝组PKCγ蛋白表达与对照组比较有降低趋势（P<0?05)；(3)各染铝组PKCγ mRNA表达与对照组比较均降低（P<0?05)，0?2％与0?4%，0?6％组间比较差异有统计学意义（P<0? 05)。结论 慢性铝暴露影响大鼠海马PKCγ mRNA和PKCγ蛋白表达，使PKC活性降低，导致LTP的下降，从而影响学习记忆的功能。

【关键词】  蛋白激酶Cγ亚型（PKCγ）

　　铝是一种具有神经毒性的元素，能影响神经系统的多种功能，特别是能损害人的学习与记忆功能〔1〕。铝可在脑组织中蓄积，引起中枢神经功能紊乱。铝进入脑神经细胞内，干扰脑细胞活动，破坏神经元结构，形成神经纤维缠结，导致中枢神经功能障碍。因此，铝可通过慢性蓄积并作用于中枢神经系统引起神经系统的慢性退行性病变，发挥神经毒性作用〔2〕。本文通过研究慢性铝暴露PKCγ蛋白表达和mRNA表达，来探讨铝暴露损害学习记忆功能的机制。

　　1   材料与方法

　　1?1   材料与试剂   Wistar大鼠(医科大学动物室)；高速离心机（美国LKB公司）；液闪仪（美国BECK-MAN公司）；鱼精蛋白、兔抗鼠PKCγ抗体和显色试剂盒(美国Sigma公司）；PKCγ引物（北京奥科生物技术有限责任公司）；RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗（北京中衫生物公司）；［γ-32P］-ATP（北京福瑞公司）；其他试剂均为分析纯。

　　1?2   染铝动物模型   选择断乳后Witar大鼠体重30g，雌雄各半，随机分为4组，每组20只。根据本实验室前期所作工作及相关〔3〕，对照组喂蒸馏水，染铝组分别喂含0?2%，0?4%，0?6%氯化铝的水。待鼠饲养3个月后，给予高频刺激。

　　1?3   测量LTP   见文献〔4〕。

　　1?4   蛋白提取和PKC活性测定   见文献〔5〕。

　　1?5   检测PKCγ蛋白表达的情况   见文献〔6〕。先测定上述提取液胞浆和胞膜的蛋白含量，再进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳、蛋白的转移，印迹膜与一抗及HRP标记的二抗相继温孵后，经反复漂洗，然后将蛋白印迹显影图扫描，利用Chemi Imager 5500 V2103图像分析软件对实验结果进行分析，灰度值代表蛋白含量，以对照组蛋白含量为100，铝中毒组与其对比。

　　1?6   用RT-PCR检测PKCγ的mRNA表达情况   （1)总RNA提取：取大鼠海马50～100?mg，按V-gene试剂盒说明书操作提取。(2)cDNA合成：按Takara RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录反应，总反应体积20μl。(3)  PCR反应：应用Primer Premier 5?0软件设计引物，PKCγ的上游引物为：5′-ACCAAGCACCCAGGAAAAC-3′ PKCγ的下游引物为：5′-GATGCTGGCTAGAACCAAGC-3′。PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s,51?5℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环，72℃延伸10min。β-actin的上游引物为5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3' β-actin的下游引物为：5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，产物长度为701bp。PCR反应条件同上。(4) PCR产物的分析：取PCR扩增后的产物51μl进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，利用凝胶自动分析成像软件Chem Image 5500进行灰度值分析，利用β-actin灰度值为内对照，求出PKCγ mRNA量的相对值。

　　1?7   统计分析   采用SPSS 10?0软件进行单因素方差分析。

　　2   结果

　　2?1   血铝和脑铝的浓度（表1)   随铝浓度的增加，血铝和脑铝的浓度随之增加。染铝组与对照组比较,差异有统计学意义（P<0?05)；0?2%与0?4%组比较,差异有统计学意义（P<0?01)；0?4%与0?6%组比较，差异无统计学意义（P>0?05)。

　　表1   各组大鼠血铝和脑铝的比较（略）

　　注：与对照组比较，a P<0?01;与0?2%比较，b P<0?01

　　2?2   LTP的测定结果   染铝组大部分大鼠海马齿状回LTP增强幅度与对照组比较均有下降。染铝各组高频刺激后LTP增加的群体峰电位（PS）幅值比率（0?2%组，0?4%组，0?6％组）与对照组相比均明显降低，随着染铝剂量的增加，LTP增加的PS幅值比率逐渐下降；在对照组中高频刺激后PS幅值稳定且增长平均在150％左右，符合正常的生理现象，而染铝组高频刺激后PS幅值基本与初始相同，在45min以后其PS幅值仍然没有上升到正常的生理范围，表明染铝抑制了大鼠LTP的发生和维持；此外在染铝组均出现了有长时程抑制（LTD)的现象，而对照组却未有一例出现。

　　2?3   胞浆和胞膜的PKC活性结果（表2）   各染铝组细胞膜PKC活性与对照比较，差异有统计学意义（P<0?01)，但染毒组间差异无统计学意义（P>0?05)。各染铝组细胞浆PKC活性与对照比较，差异无统计学意义（P>0?05)，染铝组间差异无统计学意义（P>0?05)。细胞膜PKC活性高于细胞浆PKC的活性。

　　表2   各组大鼠胞膜和胞浆PKC活性的比较（略）

　　注：与对照组比较，a P<0?01

　　2?4   PKCγ蛋白表达的结果（图1）   各染铝组PKCγ的非磷酸化蛋白表达与对照组灰度值的比较，差异有统计学意义（P<0?05)；染铝组间灰度值的比较，0?2％与0?6％组，P<0?05;0?2％与0?4％组；0?4％与0?6％差异无统计学意义（P>0?05)。

　　2?5   PKCγmRNA表达的结果（图2）   各染铝组PKCγ的mRNA表达与对照组灰度值比较，差异有统计学意义(P<0?05);0?2％与0?4%,0?6％组间灰度值的比较，差异有统计学意义（P<0?05);0?4％与0?6％组比较，差异无统计学意义（P>0?05)。

　　图1   不同浓度铝中毒大鼠海马PKCγ的非磷酸化蛋白表达（略）

　　图2   不同浓度铝中毒大鼠海马PKCγ的mRNA表达（略）

　　3   讨论

　　近年来研究证明〔7〕，PKC与突触可塑性及LTP的形成密切相关，PKC的激活是LTP产生的重要条件。现有理论认为，诱导LTP的高频刺激促进了突触前膜谷氨酸递质的大量释放，使突触后膜去极化叠加而达到一定程度，从而逐出堵塞后膜N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDA)通道的Mg2+。这样当递质与NMDA受体结合后，通道开放，Ca2+内流，胞内Ca2+浓度升高，继而触发胞内一系列生化反应，特别是PKC和Ca2+/钙调蛋白（Calmodul in,CaM)-依赖性蛋白酶信号传递系统及其参与调节胞内CaM游离水平的神经特异性蛋白质神经颗粒素（Ng）的变化等，改变膜的性质，导致LTP的产生〔8〕。现己证明，极低浓度铝即可取代这一反应中的Ca2+，而PKC对铝取代钙的作用非常敏感。本实验结果也表明，染铝组随铝浓度的增加，血铝和脑铝浓度随之增加，大鼠脑海马在高频刺激后引起LTP的幅值均下降，细胞膜的PKC活性显著下降，细胞浆PKC活性变化不大。说明慢性染铝大鼠海马在高频刺激后，抑制细胞膜PKC活性。从而影响了Ca2+依赖性谷氨酸盐释放，降低了突触后膜对递质的敏感性；同时还影响了Ca2+经电压依赖性通道进一步内流，从而影响LTP的形成。结果还表明，0?4％与0?6％染铝组间的差异不大，有可能是机体存在机能代偿性的结果，低浓度铝干扰LTP的形成。在神经细胞内PKC亚型主要以γ亚型为主。有报道，长期记忆的形成需要全新的mRNA和蛋白质合成〔9〕，因此，本实验对PKCγ蛋白表达和RNA表达水平进行了研究。PKCγ蛋白表达的实验结果表明，染毒组与对照组灰度值比较差异有统计学意义。提示铝不仅影响PKC活性，也影响PKCγ的蛋白表达。即PKC活性有可能受铝的影响，又有可能受到PKCγ蛋白表达的影响。PKCγ的mRNA表达实验结果表明，染铝组与对照组的灰度值比较明显降低，而且染铝组间灰度值的比较，0?2％与0?4%，0?6％组比较差异有统计学意义，提示铝也影响到PKCγ mRNA表达，而且随铝浓度的增加，PKCγ mRNA表达明显降低。PKCγ mRNA表达降低，会影响PKCγ的蛋白表达，也会影响到PKC的活性。总之，由于铝暴露，可能引起大鼠海马PKCγ转录、翻译及其调节等方面发生的变化，从而影响学习记忆的功能紊乱。其作用机制还有待于进一步研究。

【】
  　　〔1〕 胡剑峰，晏云霞，肖鸿美，等.铝对学习记忆的影响及其可能的机制［J］.临床康复，2005，9（5）：140-142.

　　〔2〕 颜世铭，洪昭毅，李增禧.实用元素医学［M］.郑州：河南医科大学出版社，1999：337.

　　〔3〕 杨荣.铝对学习记忆的抑制作用及其机理［J］.江汉大学学报：版，2005，2（33）：82-86.
　　
　　〔4〕 杨菁，孙黎光，宗志宏，等.慢性染铝对海马CA1区LTP及ERK2活性影响［J］.中国公共卫生，2004，20（1）：21.

　　〔5〕 邢伟，孙黎光，时利德，等.染铝鼠海马PKC活性与LTP的相关性研究［J］.卫生毒杂志，1996，10（3）：155-156.

　　〔6〕 Gastman BR,Yin XM,Johnson DE,et al.Tumor-induced apoptosis of T cell:amplification by a mitochondrialcascade［J］.Cascer Res,2000，60:6811-6817.

　　〔7〕 魏小龙，张永祥.蛋白激酶与阿尔采末病［J］.生理科学进展，1999，30（4）：359-362.

　　〔8〕 孙焰瑛，徐鹏霄.LTP形成机制的研究进展［J］.国外医学：生理、病理科学与临床分册，2003，23（5）：519-521.

　　〔9〕 J David Sweatt Mitogon.Activated protein kinases in synaptic plasticity and memory［J］.Current Opinion in Neurobiology,2004，14:311-317.