重组腺病毒载体介导人DeltaNp73α转染对树突状细胞凋亡的抑制作用

                                            作者：胡义杰 范士志 蒋耀光 李志平 陈建明 何勇

【摘要】  　　目的： 研究人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染人脐血来源树突状细胞（DC）对其成熟状态及其凋亡水平的影响. 方法： 用Adeasy系统构建人DeltaNp73α基因重组腺病毒；并通过增强离心法将其转染至人脐血来源DC；流式细胞仪分析转染后DC的成熟状态以及DC的凋亡水平. 结果： 成功构建了人DeltaNp73α基因重组腺病毒并高效转染DC；人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染提高了DCCD83，HLA?DR的表达，并能显著抑制其凋亡水平. 结论： 人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染DC，促进DC的成熟并抑制其凋亡，将有效地提高DC疫苗的抗原呈递能力.

【关键词】  DeltaNp73α 重组 遗传 腺病毒科 树突细胞 树突细胞疫苗

      0引言

    免疫是肿瘤目前极有前景的治疗手段之一. 激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是实现肿瘤主动免疫治疗的关键. 树突状细胞(dendritic cell， DC)能摄取特异性相关抗原、高水平的表达与抗原递呈有关的MHC?I，MHC?Ⅱ分子、多种共刺激分子及黏附分子，从而激活初始T淋巴细胞. 肿瘤细胞通过分泌一些免疫抑制因子来抑制DC的成熟及其功能，甚至通过相关信号通路诱导DC细胞的凋亡［1］. 具有抑制细胞作用的DeltaNp73α属于p53基因家族，其在肺癌组织中表达量和阳性表达率明显升高，是肺癌免疫治疗中较好的靶点. 我们拟通过构建DeltaNp73α的重组腺病毒（adenovirus, Ad）并转染人DC，使DeltaNp73α在DC内稳定高表达、呈递，并探讨DeltaNp73α高表达对DC活化状态及凋亡水平的影响.

    1材料和方法

    1.1材料真核表达质粒pcDNA3?DeltaNp73α?HA由意大利罗马大学Gerry Melino教授和Vincenzo De laurenzi博士惠赠，含DeltaNp73α基因cDNA全长约1700 bp. PAdTrack?CMV，293T细胞，E. coli BJ5183，DH5α大肠杆菌由第三军医大学西南烧伤研究所提供. KpnI， XbaI， PmeI， PacI限制性内切酶以及T4DNA连接酶（NEB公司）；脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒（Invitrogen公司）；大小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA PCR Kit（TaKaRa公司）；人淋巴细胞分离液（B&D公司）；人白细胞介素IL?4，人粒?单核集落刺激因子GM?CSF，肿瘤坏死因子TNF?α（Perprotech公司）；Anti?HA Tag Mouse monoclonal Antibody（Applygen公司）；Tripure Reagent（百泰克生物公司）；MC?CelLytics Mammalian Cell Protein Extraction Reagent，BCA蛋白质定量测定试剂盒（上海申能博彩生物公司）；goat anti?mouse IgG/HRP二抗（Biosythesis公司）；PE?anti?CD1a,PE?anti?CD83,PE?anti?HLA?DR及其同型对照（美国BioLegend公司）；PE?Annexin V凋亡试剂盒（晶美生物公司）.  根据GenBank中DeltaNp73α cDNA的序列，应用Primer 5软件设计针对其的特异引物并由Invitrogen公司合成.

    1.2方法

    1.2.1复制缺陷性腺病毒Ad?DeltaNp73α的构建复制缺陷性腺病毒Ad?DeltaNp73α含全长人DeltaNp73α cDNA，由我科通过AdEasy系统构建. 50%组织培养转染剂量法（TCID50）测得病毒的滴度（M.O.I）为2.5×1011pfu/L.

    1.2.2人脐带血来源DC的分离培养经产妇同意后，取剖腹产时新生儿脐带血（125×103 U/L肝素抗凝），经人淋巴细胞分离液密度梯度离心法［2］分离出单个核细胞，37℃, 50 mL/L CO2孵箱孵育. 2 h后转移未贴壁细胞至另一离心管供分离T细胞，贴壁细胞更换含有细胞因子IL?4（1000×103 U/L），GM?CSF（1000×103 U/L）的培养基继续培养. 间隔1 d半量更换培养基，补充细胞因子IL?4, GM?CSF. 第6日收获未成熟DC（immature dendritic cells, iDC）；或者第5日换液时加入TNF?α（50×103  ng/L），刺激48 h后即第7日收获成熟DC（mature dendritic cells, mDC）.

    1.2.3重组腺病毒增强离心法转染DC参照［3］，采用离心法增强腺病毒转染DC.

    1.2.4转染后DC中DeltaNp73α的表达收集DC,腺病毒转染48 h的DC/Ad?DeltaNp73α以及对照组的DC/Ad?ctrl. RT?PCR分析DeltaNp73α mRNA水平； Western Blot分析DeltaNp73α蛋白表达水平.

    1.2.5转染前后DC表面标志物的变化收集DC，PBS洗涤细胞后，分别加入待检测的CD1a，CD83及HLA?DR抗体及其同型对照；4℃避光孵育30 min后，PBS液洗涤2次后上机检测.

    1.2.6DC凋亡水平的变化转染7 d收集DeltaNp73α腺病毒感染的DC（对照组采用正常培养DC, Ad?EGFP转染的DC）；将细胞悬浮在1×结合缓冲液中，调整密度为（2～5）×108/L；将细胞悬液和PE标记Annexin V混合，室温孵育10 min；离心，PBS洗涤细胞；使用1×结合缓冲液重悬细胞；PI染色细胞（终浓度为1×103 μg/L），流式细胞仪分析.

    统计学处理： 用 SPSS11.0软件分析数据；P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著.

    2结果

    2.1DC的分离在诱导培养DC过程中，第5日在光镜下即可见细胞呈半悬浮生长，胞膜向外延伸出树枝状突起，CD1a+细胞约占29%. 加入TNF?α刺激48 h后其突起明显增多. 培养7 d时表型检测CD83细胞约占91%，HLA?DR表达约占92%，均较各自未成熟组明显增多. 扫描电镜观察，胞质突起形成典型的树枝状，并可见DC的粗糙表面（图1）.

    2.1重组腺病毒转染DC以及DeltaNp73α的表达采用200 M.O.I重组DeltaNp73α腺病毒有效转染iDC（图2）. 绝大部分细胞均出现绿色荧光的表达；最佳M.O.I根据转染过后的效率以及对DC的细胞毒性综合优化为200（具体数据未列出）. RT?PCR及Western Blot结果证实通过200 M.O.I重组腺病毒转染DC后，可以观察到DeltaNp73α mRNA及其蛋白在DC中的表达（图3）.

    2.3标志物的变化转染后的DC表面分子CD83，HLA?DR均较iDC表达水平增加，接近mDC水平（图4）. CD83，HLA?DR表达的上调在Ad?DeltaNp73α和Ad?ctrl组间没有差异，提示DeltaNp73α对DC表面分子的表达没有明显作用.

    2.4凋亡水平的改变重组腺病毒转染DC 7 d后， DeltaNp73α组DC存活率显著高于另外两组；而正常培养DC以及空腺病毒载体转染组之间没有显著差异. 同时，DeltaNp73α组DCs的存活率达（71.0±2.8）%，显著高于另两组；而正常培养DC以及空腺病毒载体转染组之间没有显著差异（分别为（53.5±0.7）%，（45.5±3.5）%).

   3讨论

    DC是启动免疫反应最关键的抗原呈递细胞，但由于DC具有高度不均质性，其分化以及功能很容易受外界因素的影响；且恶性肿瘤可以通过分泌一系列的免疫抑制因子，致使DC功能失调，从而系统的影响免疫抗瘤效应. 我们采用在体外诱导培养DC，经含全长DeltaNp73α基因重组腺病毒修饰，探讨DC功能变化及进一步用于抗瘤的可行性.

    首先，肿瘤可以干预DC的成熟状态；而重组腺病毒转染可促进DC的活化. 从多种肿瘤患者肿瘤中分离的DC，其共刺激分子CD80，CD86等均低表达，即表型主要为未成熟表型，其T细胞刺激能力明显减弱，体外诱导同源CD4+ T细胞无力；是否诱导T细胞的死亡［4］. 未成熟DC对成熟刺激因子GM?CSF，TNF?α或CD40L均呈低反应性，提示并非缺乏成熟刺激因子，可能是肿瘤相关产物抑制了其成熟. 我们的实验结果显示DeltaNp73α对DC的成熟并没有直接的影响，但重组腺病毒的转染，可以显著提高相关共刺激分子的表达，促进DC的成熟；而DeltaNp73α的表达，却显著地诱导了HLA?DR的表达，提示DC高效表达MHC I类和MHC II类分子，为下一步的有效抗原呈递提供了基础.

    其次，肿瘤患者体内易发生DC的自发性凋亡以及T细胞、肿瘤细胞介导的DC凋亡［5］；而DeltaNp73α重组腺病毒转染可抑制DC的凋亡，提高其生存率. 相比于iDC，mDC更容易发生自发性凋亡［6］.  DC与CD4+ T细胞发生抗原特异性作用后，DC立即进入凋亡过程；该过程部分受CD95?CD95L（即Fas?FasL）信号通路的调节. 已经证实DC的生存期显著影响着在体DC诱导T细胞聚集增殖能力以及维持有效抑瘤免疫学效应的能力［7］. 通过TNF受体修饰DC，可以显著抑制DC的自发性凋亡，使其生存期长于正常对照DC以及空病毒载体转染的DC［8］. 瘤内注射表达抗凋亡分子BCL?XL的DC疫苗可以诱导更强的抗瘤效应；并证实与DC生存期延长相关［9］. 本研究DC的生存率明显高于正常对照DC以及含EGFP病毒转染的DC，亦即DeltaNp73α可以抑制DC细胞的自发性或诱导性凋亡，这将提高DeltaNp73α修饰DC的T细胞聚集增殖能力以及有效抑瘤免疫反应能力.

【】
  ［1］ Uramoto H, Sugio K, Oyama T, et al. Expression of the p53 family in lung cancer ［J］. Anticancer Res，2006，26(3A):1785-1790.

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［3］ Nishimura N, Nishioka Y, Shinohara T, et al. Enhanced efficiency by centrifugal manipulation of adenovirus?mediated interleukin 12 gene transduction into human monocyte?derived dendritic cells ［J］. Hum Gene Ther， 2001，12(4):333-346.

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