低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定

【摘要】  目的：构建针对核心结合因子a1（Cbfa1）的mU6小干扰RNA载体，并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs，观察其干扰效果，以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型. 方法：设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中，对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定. 以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系. 用含G418的培养液筛选，挑取阳性克隆后用RT?PCR技术检测各hPDLCs克隆内Cbfa1 mRNA水平的表达情况. 结果：经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒Cbfa1?siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致. G418筛选转染细胞4wk后获得稳定转染mU6空载体的细胞克隆株hPDLCs?mU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCs?siRNA. 经RT?PCR鉴定，Cbfa1在hPDLCs?siRNA细胞中的表达比对照细胞明显降低. 结论：成功构建了针对Cbfa1的小干扰RNA载体，成功建立了稳定的低表达Cbfa1的hPDLCs模型，为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.

【关键词】  Cbfa1基因

　　0引言

　　核心结合因子a1（core binding factor a1, Cbfa1）是一种成骨分化特异性转录因子，参与了成骨细胞的发生与分化，对维持骨的生长发育起着关键作用［1-4］. 研究［5-7］发现，Cbfa1在牙齿发育过程中呈保守表达， 可能是牙齿发育和矿化的重要转录调控因子， 在牙齿发育过程中发挥重要作用. 我们以人牙周膜细胞（hPDLCs）为对象, 建立了低表达Cbfa1的细胞模型， 为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料hPDLCs引自美国典型培养物保存中心(ATCC)；mU6载体为美国Michigan大学医学院Tumer教授赠送；T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶（TaKaRa公司）；脂质体转染试剂Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）；RPMI 1640，G418（Gibco公司）；RNA抽提试剂盒（上海华舜公司）.

　　1.2Cbfa1 siRNA载体的构建根据GenBank Cbfa1基因的已知序列设计其siRNA的序列：上游引物：5′?tttgcggagtagttctcgtcatacaatgacgagaactactccgcttttt?3′,下游引物：5′?ctagaaaaagcggagtagttctcgtcattgtatgacga?
gaactactccg?3′. 上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为Cbfa1高度保守后，由 Sangon公司合成. 退火后酶切mU6质粒，行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，回收线性化载体，将退火产物和回收产物定量后于16℃连接16 h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌. 37℃培养12～18 h. 挑选单克隆扩增后进行酶切鉴定和DNA测序.

　　1.3细胞培养与转染将hPDLCs常规培养于100 mL/L RPMI 1640培养液中. G418筛选浓度的确定：将hPDLCs接种于6孔板（2×105/孔）. G418按100，200，300，400，500，600，700，800 mg/L的终浓度加入各孔细胞，观察细胞生长状况，以第8日细胞全部死亡的最低浓度为筛选浓度. 确定筛选浓度为300 mg/L. 取对数生长期hPDLCs，接种于6孔板（5×105/孔），在50 mL/L CO2培养箱中过夜，直至细胞80%饱和. 在1 mL RPMI 1640培养液中加10 μg质粒（分别加入重组质粒mU6?Cbfa1，空载体mU6）振荡混匀，加入lipofectinamine脂质体悬液10 μL，室温温育15 min. 弃去培养基,用无血清培养基洗2次, 逐滴缓慢加入预先制备的质粒ＤＮＡ/脂质体复合液, 37℃，50 mL/L CO2培养箱中温育5 h后补充1 mL 200 mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养. 30 h后改用含G418 300 mg/L的培养液筛选，挑取阳性克隆并进行扩增培养. 设立mU6空载体转染细胞作为对照. 阳性克隆株分别命名为hPDLCs?siRNA和hPDLCs?mU6细胞，以RT?PCR进行鉴定.

　　1.4RT?PCR用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA并定量，取10 μg的总RNA和Oligo dT(15) 4 μL进行反转录，于70℃ 10 min后置于冰上，再依次加入5×Buffer 10 μL，dNTP 2 μL，AMV 1 μL，RNasin 1 μL，去离子水补至50 μL，42℃孵育2 h后冰冻保存. 常规进行PCR扩增，反应引物Cbfa1: 5′?cacctcggaactgaacccat?3′和5′?gcctccacgccatcactct?3′；β?actin: 5′?agcgggaaatcgtgcgtg?3′和5′?cagggtacatggtggtgcc?3′. 将PCR反应产物行12 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线灯下观察并照相.

　　2结果

　　2.1Cbfa1的小干扰RNA载体的构建和鉴定根据GenBank提供的Cbfa1基因cDNA序列，设计合成发夹样Cbfa1 siRNA. mU6?Cbfa1 siRNA真核表达质粒和空载体被XbaⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，分别形成400 bp和1100 bp的DNA片段，与预计片段长度相同（图 1）.

　　2.2Cbfa1低表达的细胞模型的建立G418筛选转染细胞4 wk后获得稳定克隆株. 经RT?PCR鉴定（图2）， Cbfa1在hPDLCs?siRNA细胞中的表达比对照细胞hPDLCs?mU6明显降低，说明成功建立了Cbfa1低表达的细胞模型.

　　图1－图2　略

　　3讨论

　　Cbfa1是近几年发现的与骨发育密切相关的转录因子，在成骨细胞分化和骨形成过程中发挥重要作用. Cbfa1是调控成骨细胞特异性基因的主控基因，该基因只在与成骨相关的细胞中表达，如果在非成骨细胞中强制表达，则该细胞出现成骨细胞的特性［2，8-9］. 研究表明， 敲出Cbfa1后小鼠的成骨细胞功能下降，包括成骨细胞数量减少、组织中骨基质蛋白缺乏以及碱性磷酸酶活性降低等［10-11］. Cbfa1还参与了乳恒牙替换过程中牙槽骨的改建与乳牙根吸收的过程，在促进成骨分化的同时参与了对破骨细胞的生长及活性的调节. 目前，在多个牙齿特异性的基因的启动子上发现了Cbfa1的结合位点，推测Cbfa1可能通过调控多种分子通路在牙齿发育中发挥着重大作用. 迄今为止，Cbfa1对hPDLCs的调控作用尚不清楚.

　　
　　为了探讨Cbfa1的表达对hPDLCs的作用，首先要选择一个有效的技术沉默此基因的表达. RNA干扰是一门具有高效、特异、持久的对目的基因表达进行阻断的技术. 与反义核酸相比，RNA干扰造成的基因抑制效率更高、特异性更好，以致于可以和基因敲除相媲美，但其较基因敲除简便、快速、，因此具有广阔的应用前景［12-13］. 我们成功制备了Cbfa1的小干扰RNA真核表达载体，并建立了稳定低表达Cbfa1的细胞亚系，为深入研究Cbfa1在牙齿发育过程中的功能奠定了基础.

 

【】
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