大鼠脊髓渐进性压迫减压后神经细胞黏附分子的表达

                           作者：毋崇岭，孙正义， 汪玉良，史迎宾， 陈文华

【摘要】  目的：研究大鼠脊髓渐进性压迫减压后修复过程中神经细胞黏附分子(NCAM)的表达情况. 方法： Wistar大鼠51只，分为空白对照组（n=3）和损伤组（n=48）. 空白对照组不做任何处理，常规饲养；损伤组用螺钉压迫法造成脊髓渐进性压迫模型，压迫至中度开始减压. 按减压后不同时间点又分为1，3，5，7，14和28 d 6个组，每组动物8只. 用免疫组织化学SABC法测定NCAM在脊髓灰质神经元中的表达，并采用机Mias软件进行图像分析. 结果：各组灰度值：空白对照组：245.53±3.47；损伤组减压后1 d组：235.33±6.48；3 d组：218.86±2.67；5 d组：198.39±3.24；7 d组：173.15±5.98；14 d组：190.45±4.93；28 d组：227.68±2.85. 与空白对照组相比脊髓渐进性损伤组各不同时间点组均有NCAM的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)，其中以减压后7 d NCAM的表达量最高. 结论: 在脊髓渐进性压迫减压后的修复过程中NCAM均有表达，NCAM表达量的变化可能与脊髓损伤后的修复有关.

【关键词】  神经细胞黏附分子；脊髓损伤

　　0引言

　　脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种严重的继发于高能量创伤的中枢神经系统疾患，其病理改变包括轴突的断裂、髓鞘的崩解以及神经细胞的坏死和凋亡［1］. 造成损伤的原因有外伤性和非外伤性. 外伤性损伤是受到机械外力作用包括直接或间接的外力作用而造成脊髓结构与功能的损害，为急性损伤；而非外伤性的损害则多为肿瘤、结核、椎管畸形等原因所造成，为慢性损伤［2］. 慢性脊髓损伤在致病因素去除后其神经功能可以获得一定程度的恢复，神经系统本身具有一定的自我恢复能力［3］. 近年来有关人脊髓损伤的研究受到关注. 神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule, NCAM ）是细胞表面的一种糖蛋白，在神经系统发育过程中与轴突生长延伸，突触结构的维持，模式重建以及神经元的出芽有着密切关系，是中枢神经系统功能修复的标志物 ［4］ . 我们采用免疫组织化学SABC法对脊髓渐进性压迫损伤修复过程中NCAM的表达进行了研究，为从分子水平阐明NCAM与慢性压迫性脊髓损伤后神经修复的机制，为寻找有效的方法提供新的思路.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康清洁级成年Wistar大鼠51只，雌雄不限，平均体质量300 g (由兰州大学实验动物中心提供). 高压蒸汽消毒锅（DSX?280B型，上海申安医疗器械厂）；Mias图像分析软件（四川大学图像图形研究所研制）；光学显微镜及配套数码相机（XS?402型，南京江南光电股份有限公司）；切片机(KD?2508型(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；兔抗大鼠NCAM抗体，即用型SABC试剂盒，DAB显色剂（购自武汉博士德生物工程有限公司）；抗原修复液，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.4），40 g/L多聚甲醛，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.4），0.5 mol/L水合氯醛，30 mL/L过氧化氢（自行配制）.

　　1.2方法

　　1.2.1模型制备随机取大鼠3只作为空白对照组，剩余48只为损伤组. 空白对照组大鼠不做任何处理，常规饲养. 损伤组大鼠用0.5 mol/L水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧位固定，背部剃毛，常规碘酒酒精消毒，以T10棘突为中心，正中切开皮肤及皮下组织（切口长约1.5 cm），分离椎旁肌肉，显露椎板及棘突，咬除T10棘突，保留脊突根部. 用不朽钢螺钉（直径为0.25 cm,螺距为0.5 mm）在脊突根部中点凿孔直至显露硬脊膜，再安装同样大小的塑料螺钉，逐层缝合. 操作过程中注意不损伤脊髓. 24 h后检查下肢功能未受损伤，随后每7 d背部切开5 mm小口，显露并缓慢旋进螺钉1次，每次旋进1/8圈制作大鼠脊髓后路渐进性压迫模型. 压迫至中度后（CR=40％，CR指压迫物占椎管矢状径的百分比）减压. 损伤组大鼠减压后按不同时间点又分为： 1，3，5，7，14和28 d 6个组每组动物8只.

　　1.2.2神经功能评分损伤组大鼠处死前行改良的Tarlov评分、斜板试验. 对大鼠进行行为及肢体运动功能检测，观察伤后各时间点大鼠后肢的活动、肌力等功能恢复情况. 评分标准：I改良的Tarlov 评分：0分：后肢无自主运动；1 分：后肢有自主运动，但无法站立，仅限于髋、膝关节的非反射性运动；2分：能站立但无法行走，仅限于肢体髋、膝、踝3个主要关节的运动；3分：能行走，但有中度强直，能主动支持体质量和不协调步态，或偶尔出现协调步态；4分：能行走，轻度强直或有共济失调，前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动；5分：正常步态. Ⅱ 斜板实验：采用Rivlin法. 固定长方形木制斜板，将大鼠身体纵轴与斜板纵轴平行、头朝斜板抬高侧放置，测定大鼠能停留5 s的最大斜板倾斜角度，每只动物测5次，取其平均值作为测定值.

　　1.2.3组织取材在不同时间点用0.5 mol/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，胸腹部剃毛，常规碘酒、酒精消毒，铺无菌巾，取前正中切口，打开胸腔，于主动脉根部置一根医用4号缝线，剪开左心室置管入主动脉升部，用丝线结扎固定，剪开右心耳，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH =7.4）快速灌洗至组织变白，然后用40 g/L多聚甲醛，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH =7.4）500 mL灌注固定. 0.5 h后取自损伤边缘至远、近端各5 mm两段脊髓组织；空白对照组大鼠则择时取相应节段脊髓. 标本取出后随即用40 g/L多聚甲醛固定后石蜡包埋，切片（厚度5 μm），以备免疫组织化学染色.

　　1.2.4免疫组织化学采用SABC法，按其试剂盒说明书步骤进行. 显微镜下观察，照相.

　　1.2.5图像分析NCAM染色以神经元细胞及其突起呈棕黄色为阳性，采用Mias图像分析软件测量各组脊髓灰质NCAM的表达量. 物镜放大10倍视野下，随机选择视野中阳性反应细胞并测定其灰度值，灰度值与细胞反应强度成反比，每次取5个视野，以其平均值作为测定值.

　　统计学处理：计量数据均以x±s表示，应用SPSS 12.0统计软件分析，不同时间点损伤组间比较采用方差分析，组间方差不齐的采用非参数Kruskal?Wallis秩和检验，同一指标不同时间点的数据比较采用重复测量的方差分析，进一步的多重比较采用Dunnett?t法，检验水准取α=0.05.

　　2结果

　　2.1行为学评分脊髓渐进性压迫损伤后48只大鼠均出现不同程度的后肢功能障碍，损伤组各不同时间点组大鼠的行为学评分与空白对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05,表1).

　　表1减压后各组行为学评分的比较(略)

　　2.2NCAM表达空白对照组脊髓灰质中NCAM的表达极少， 损伤组各不同时间点组在脊髓灰质前后角表达量明显增加. 与空白对照组（245.54±3.47）比较， 减压后1 d组（235.33±6.48）； 3 d组（218.86±2.67）；5 d组（198.39±3.24）；7 d组（173.15±5.98）；14 d组（190.45±4.93）和28 d组（227.68±2.85），各组NCAM表达量均增加，差异有统计学意义(P<0.01). 提示脊髓渐进性压迫损伤后NCAM大量表达（图1）.

　　图1大鼠脊髓渐进性压迫及减压后NCAM的表达×400　略

　　3讨论

　　NCAM是细胞表面的一种糖蛋白，介导细胞的黏附和识别，在动物中的存在形式主要有三种：NCAM?120, NCAM?140和NCAM?180. NCAM含有以α2，8相连的多聚唾液酸复合物(polysialic acid, PSA). PSA表达高时,增加NCAM之间的排斥作用,减少黏附性,有利于神经向外生长; PSA表达减少时,将增加黏附作用,维持结构的功能. 在神经生长发育、损伤修复阶段,NCAM外围形成的带负电荷的PSA水化球表达水平较高，随着发育成熟,PSA的水平逐渐降低. 研究显示PSA?NCAM是中枢神经可塑性的重要调节因素［5］，PSA?NCAM主要在重塑活跃的神经组织中大量表达以调控轴突生长、细胞迁移和突触重塑，表达水平与神经细胞的迁移、轴突的延伸密切相关，是移行细胞可塑性的重要标志. PSA?NCAM促进轴突再生的机制包括：为神经元突起生长提供更具黏附性的基质，加速生长椎基底部胞质膜的扩张而促进突起的延伸. 曹阳等［6］研究显示，脊髓损伤后室管膜细胞有PSA?NCAM的表达，在3 d开始增加，7 d达到高峰，14 d后开始下降，但仍高于对照组，结果提示NCAM参与了伤后脊髓的结构修复. 此结果与本实验的结果是一致的.  Fox等［7］研究还发现增加的PSA?NCAM 能降低细胞的粘附性，促进轴突发生. 在长时程的建立中，PSA?NCAM 可能帮助神经元联系的结构重建，对少突胶质祖细胞的迁移起重要作用 ［8］ . 研究还表明，NCAM能显著刺激神经生长［9］,还能刺激胚胎干细胞向神经细胞高效能分化［10］；在髓鞘的形成和再生过程中也具有极其重要作用［11］. 由此提示，中枢神经损伤后NCAM在神经纤维的再生中促进轴突生长、神经元联系的结构重建等方面具有不可忽视的作用，与损伤后的修复密切相关.
　　
　　本研究结果显示，NCAM免疫阳性细胞在脊髓渐进性压迫损伤减压后各时间点均有不同程度的表达，说明压迫性损伤可刺激NCAM的表达，提示NCAM对压迫性脊髓损伤后神经的修复起了重要的作用. NCAM表达变化的研究，其表达如何介导以及与细胞内事件的连接仍待深入研究.

【】
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