可溶性人PD?1IgV（shPD?1IgV）活性检测及抑瘤作用的观察
【摘要】 目的：检测可溶性人PD?1IgV（shPD?1IgV）的活性，观察其抑瘤效果. 方法：利用Ni?NTA亲和层析和分子筛层析纯化蛋白，对其进行复性得到可溶性人PD?1IgV（shPD?1IgV）. 通过结合ELISA和竞争ELISA检测shPD?1IgV生物学活性，抑瘤率检测其抑瘤效果. 结果：高效气相色谱分析结果表明纯化复性的shPD?1IgV蛋白的纯度达到95%以上；shPD?1IgV能够分别与鼠源性和人源性B7H1/Fc结合；其与人源性B7H1/Fc的结合可被抗人B7H1 mAb阻断；组抑瘤效果与对照组比较具有统计学意义（P<0.05）. 结论：纯化复性的可溶性人sPD?1IgV具有很高的纯度和生物学活性，体内显示了良好的抑瘤效果.
【关键词】 shPD?1IgV
0引言
Programmed death?1(PD?1,CD279)是在淋巴细胞活化过程中诱导表达的一个免疫抑制性受体，属CD28/CTLA?4/ICOS共刺激受体家族成员［1］. 它通过胞质区的两个酪氨酸残基与下游的信号分子作用而发挥对初次免疫应答和记忆性、效应性T淋巴细胞功能的负性调节［2］. PD?1是有一个胞外IgV样（Ig variable?like）结构域、跨膜结构域和胞质内尾巴组成［3-4］. 胞外IgV样（Ig variable?like）结构域在PD?1与其配体PD?L1（B7H1，CD274）和PD?L2（B7?DC）相互作用中发挥重要作用. 研究发现，肿瘤表达的PD?L1促进激活的效应性T淋巴细胞的凋亡［5］，通过51Cr释放试验表明肿瘤表达的PD?L1降低了激活的效应性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤［6］. 以抗B7?H1 mAb阻断PD?1/PD?L1通路显示了良好的肿瘤免疫治疗效果［7］. 我们旨在获得shPD?1IgV，体外检测其生物学活性，使其能与PD?L1结合，在体内阻断PD?1/PD?L1通路，从而打破肿瘤免疫逃避，达到治疗肿瘤的目的.
1材料和方法
1.1材料大肠杆菌DH5а及质粒pQE30（hPD?1IgV）为本室保存；异丙基硫化?β?D?半乳糖苷（IPTG，TaKaRa公司）；咪唑（Invitrogen公司）；氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽（Roche公司）；Ni?NTA agarose(Qiagen公司)；His标签抗体（Invitrogen公司）；hB7?H1/Fc，mB7?H1/Fc和B7?H1 mAb（R&D公司）；SP2/0细胞系为我室保存，BALB/c小鼠30只，雄性，体质量18～22g（第四军医大学实验动物中心）.
1.2方法
1.2.1shPD?1IgV的表达、纯化、复性将质粒pQE30（hPD?1 IgV）转化至大肠杆菌DH5а，37℃孵箱培养12 h，挑取单克隆， 于37℃摇床250 r/min 12 h， 1∶100转接终浓度为100 mg/L氨苄青霉素（Amp） 250 mL种子液摇瓶中培养至A600 nm=2，以1 mmol/L IPTG进行诱导4 h，收菌，4000 r/min，4℃离心15 min，超声裂菌，10 000 g，4℃离心20 min，目的蛋白以包涵体形式表达. 洗涤包涵体：50 mmol/L Tris?Cl （150 mmol/L NaCl, 10 g/L脱氧胆酸钠，15 g/L Triton X?100, pH 8.0）洗涤1次，然后以2 mol/L Urea （50 mmol/L Tris?Cl, 150 mmol NaCl, pH 8.0） 洗涤1次, 10 000 g，4℃离心20 min，沉淀以8 mol/L Urea （50 mmol/L Tris?Cl, 150 mmol/L NaCl, pH 8.0） 4℃溶解过夜，上清以S?100进行凝胶层析，收集目的峰. 对目的峰进行Ni?NTA resin亲和层析纯化，收集目的蛋白峰. 蛋白复性：Ni?NTA resin亲和层析纯化的目的蛋白溶液稀释10倍，在复性夜中加入0.2 mmol/L氧化型谷胱苷肽和1 mmol/L还原型谷胱苷肽. 梯度透析至水中，冻干. 对冻干后的shPD?1IgV蛋白以抗His mAb进行Western Blot鉴定，以HPLC进行纯度分析.
1.2.2ELISA检测shPD?1IgV与hB7H1结合活性取复性后的shPD?1IgV倍比稀释后包被96孔板，每个浓度设3个复孔，4℃包被过夜，封闭2 h，洗涤6次，2 min/次，每孔加入100 ng hB7H1/Fc，室温1 h，洗涤6次，2 min/次，加入抗hB7H1 mAb，室温1 h，洗涤6次，2 min/次，加抗鼠二抗，室温30 min，洗涤6次，2 min/次，OPD显色后检测A490 nm值，以无关含6个组氨酸（his）融合蛋白为对照.
1.2.3ELISA检测shPD?1IgV与mB7H1结合活性用96孔板包被不同浓度的mB7H1/Fc，每个浓度设3个复孔，4℃包被过夜，封闭2 h，洗涤，每孔加入500 μg shPD?1IgV，室温1 h，洗涤，加入抗组氨酸his mAb，室温1 h，洗涤，加抗鼠二抗，室温30 min，洗涤，OPD显色后检测A490 nm值，以无关含6个组氨酸（his）融合蛋白为对照.
1.2.4ELISA检测shPD?1IgV对hB7H1/Fc与抗hB7H1 mAb的竞争活性用96孔板包被100 ng hB7H1/Fc，设3个复孔，4℃包被过夜，封闭2 h，洗涤，每孔加入倍比稀释的shPD?1IgV和100 ng抗hB7H1 mAb，室温1 h，洗涤，加抗鼠二抗，室温30 min，洗涤，OPD显色后检测A490 nm值，以无关含6个组氨酸（his）融合蛋白为对照.
1.2.5抑瘤实验每只小鼠接种1×106个SP2/0细胞，待肿瘤长出后随机分成生理盐水组、5 mg/kg治疗组、10 mg/kg治疗组、15 mg/kg治疗组和环磷酰胺（CTX）组. 腹腔注射给药，治疗组每12 h注射shPD?1IgV 1次， CTX组每24 h给药1次. 连续10 d. 对照组第12 h注射生理盐水. 每日测量肿瘤体积(TV)， TV (mm3)=a×b2×π/6. 其中，a为肿瘤长径，b为与a垂直的短径.
统计学处理：用SPSS 11.0软件进行统计学分析,对统计数据进行t检验分析和方差分析，以P<0.05为有显著性差异.
2结果
2.1shPD?1IgV的纯化、复性和纯度分析包涵体形式表达的hPD?1 IgV经洗涤后以S?100凝胶层析，目的蛋白在最后一个峰（图1），收集含目的蛋白的峰，对其进行Ni?NTA resin亲和层析，以250 mmol/L咪唑洗涤得到目的蛋白峰（图2）. Western Blot结果显示纯化复性的蛋白为shPD?1IgV融合蛋白（图3），HPLC表明其纯度大于95%.
图1－图3 略
2.2shPD?1IgV的活性检测结合ELISA表明shPD?1IgV能够分别与hB7H1/Fc和mB7H1/Fc结合（图4，5），竞争ELISA结果显示shPD?1IgV可抑制hB7H1/Fc与抗hB7H1 mAb的结合（图6）.
图4－图6 略
2.3shPD?1IgV的抑瘤作用统计学结果显示，组的小鼠瘤体积与对照组有显著性差异（P<0.05，图7）. 10 mg/kg治疗组与15 mg/kg治疗组之间差异无统计学意义，但与5 mg/kg治疗组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）. 以上三组与CTX组比较也有显著性差异（P<0.05）.
3讨论
我们以质粒pQE30（hPD?1IgV）在大肠杆菌DH5а中诱导表达了hPD?1IgV融合蛋白，确定为包涵体后进行了包涵体洗涤、纯化和复性，得到了纯度大于95%的可溶性的shPD?1IgV. Ni?NTA resin亲和层析纯化得到的hPD?1IgV融合蛋白的纯度为80%，与报道一致［8］，但因其纯度不足以进行体内肿瘤治疗，故我们对方法进行了进一步的改进. 洗涤包涵体可去除部分菌体包涵体，达到初步纯化的目的［9］，因此我们首先洗涤包涵体，然后溶解，以凝胶层析进行进一步纯化，此步纯化后经灰度扫描，纯度达到70%以上，于是又对目的峰进行了Ni?NTA resin亲和层析纯化，这样得到纯度很高的hPD?1IgV蛋白. 复性过程中采取了梯度复性与透析复性相结合的办法，结果得到了可溶性的shPD?1IgV蛋白.
图7shPD?1IgV的抑瘤实验 略
体外活性检测表明shPD?1IgV能够分别与hB7H1/Fc和mB7H1/Fc结合. 虽然hB7H1与mB7H1在蛋白水平上的同源性为70%，但是其胞外区同源性为100%，因此推测shPD?1IgV可与hB7H1/Fc和mB7H1/Fc结合，实验结果也表明了这一点. 同时，shPD?1IgV可以阻断hB7H1/Fc与抗hB7H1 mAb的结合，因此，可以shPD?1IgV融合蛋白替代抗hB7H1 mAb来阻断PD?1/PD?L1通路增强抗肿瘤免疫. 体外活性实验为体内抑瘤实验提供了有力的证据. 在抑瘤实验中，由于生理盐水组在分组后第10日有1只死亡，因此选取此时为停止实验时间. 研究表明， PD?1在病毒耗竭的特异性CD8+T 淋巴细胞（CD8+T）上高表达，以抗PD?L1 mAb阻断PD?1/PD?L1通路能恢复CD8+T 淋巴细胞的功能，并且可以减少病毒对小鼠的侵袭［10］，PD?1与HIV特异性的T 淋巴细胞的表达与T 淋巴细胞耗竭和疾病过程相关［11］，以上实验表明阻断PD?1/PD?L1通路可以增强特异性T 淋巴细胞杀伤功能，提高体内免疫反应，这与我们在以shPD?1IgV进行的肿瘤治疗结果一致.
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