钬激光对兔肾VX2肿瘤的毁损效应

                            作者：石维佳，保庭毅，杨增悦，邱建新，薛力，孙文美

【摘要】  目的：探讨钬激光(Ho:YAG laser)对肾肿瘤的毁损效应. 方法：制作兔的肾VX2肿瘤模型，在手术直视下采用不同钬激光功率对肿瘤组织进行彻底照射. 观察照射后肿瘤组织及周边肾脏组织的病理变化，另外每组各5只于照射2 wk后处死,比较肿瘤的生长情况. 结果：钬激光照射后立即行HE染色可发现肿瘤细胞发生凝固性坏死，损毁灶大小随钬激光的照射参数增大而增大，并有统计学意义. 在对照实验中，所有5只照射组动物的肿瘤原发灶均被完全破坏，而对照组的肿瘤平均体积为(2645.5±174.2) mm3. 结论: 钬激光对兔的肾VX2肿瘤组织有明显杀伤作用，且有较好的可控性和操作性.

【关键词】  钬激光

　　0引言

　　钬激光是由掺钬的钇铝石榴石激光器(Ho：YAG)产生的中红外激光，因其具有良好的物理特性及生物学效应，目前已在临床上得到了广泛的应用［1-5］，然而尚无应用钬激光肾肿瘤的研究报道. 我们拟通过动物实验研究钬激光对肾肿瘤的毁损效应.

　　1材料和方法

　　1.1材料成年健康新西兰白兔30只，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg, 4～5 mo龄(第四军医大学实验动物中心). VX2瘤株种类为VX2鳞状细胞癌(第四军医大学唐都实验外科). HE染色系列试剂(第四军医大学病理教研室). 速眠新Ⅱ注射液（长春军需大学兽医研究所）.  磷酸盐缓冲液(PBS)和40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4  APES). 石蜡切片机(美国A0829)；HE染色机(日本樱花公司)光学显微镜BX?60(日本Olympus公司)；IBAS2000型机图像分析系统(德国Opton公司)；VersaPulse Powersuite  100W(美国科医人公司)；SlimLine 550 micron Blue(美国科医人公司)；Jacket Reusable Fiber和Sequoia512 型彩色超声诊断仪（美国Acuson 公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1动物模型的建立

　　1.2.1.1接种用VX2瘤株的准备把冰冻的VX2瘤株组织块由液氮中取出，37℃水复苏，生理盐水冲洗，再用PBS液冲洗后切碎，300 r/min离心约5 min. 用18 G针头l mL注射器抽吸瘤种备用. 将准备好的瘤种注射液注入兔的后腿外侧肌肉，2~3 wk后可在注射部位扪及明显的质地较硬的实质性肿块，即制成了荷瘤种兔. 依次剪开皮肤、筋膜，暴露VX2肿瘤组织，取出一部分肿瘤组织，放入盛有生理盐水的托盘内，去掉坏死的组织和筋膜，取生长旺盛的鱼肉样组织放入无菌烧杯中，加少量生理盐水，用剪刀尽量剪碎，然后加适量生理盐水制成肿瘤组织混悬液，无菌空针抽吸备用.

　　1.2.1.2兔肾VX2肿瘤动物模型的建立手术直视下肿瘤混悬组织液注射法（实验兔全部采用左肾接种）：左肾区常规消毒铺巾，在左肋缘下约2.3 cm处，依次剪开皮肤、皮下组织、肌肉及腹膜，暴露左肾，将肾脏轻轻挤出腹腔，将准备好的含肿瘤组织悬液的注射器从左肾下极进针，沿肾长轴在肾皮质内走行，边退针边将注射器中的肿瘤组织混悬液约0.5 mL轻轻推入肾皮质内，针尖退出的同时，助手用无菌明胶海绵压迫止血并防止肿瘤组织溢出，然后将左肾放回原位，逐层缝合. 术后肌注青霉素4×105 U, 4 d. 接种12 d后行B超检查种植肿瘤生长情况，未发现肿瘤生长者视为接种失败.

　　1.2.2分组及处理将接种成功的荷肾VX2肿瘤兔26只随机分为2组: ①实验组：21只行钬激光肿瘤毁损实验. 根据分组提取动物,速眠新Ⅱ注射液0.2～0.4 mL，兔臀部肌肉注射，麻醉满意后将兔右侧卧并固定于操作台上. 应用脱毛剂对手术区域进行脱毛处理；碘酒、酒精消毒腹壁；在左肋缘下约2.3 cm处做一长约8 cm的切口，依次剪开皮肤、皮下组织、肌肉及腹膜，充分暴露并游离左侧肾脏，保持肾脏的良好血运；设置钬激光参数如下：脉冲能量（1.0 J）、照射频率（40 Hz），参数的选择依据为钬激光对正常肾实质的生物学效应［6］. 将钬激光光纤头端插入18 G针头，在直视下置入肿瘤包膜下约0.5 mm深处. 大致损毁肿瘤后退出；随机处死实验组中16只动物，解剖左肾，观察钬激光损毁灶大致形态，用钢尺测量损毁肿瘤，按公式π/ 6 长×宽×高计算损毁肿瘤体积［7］，记录对应之钬激光总功率. 以损毁灶为中心，每隔1 mm切取组织至肉眼观正常肾组织处，后置于40 g/L甲醛固定、石蜡包埋、切片，进行HE染色; 未被处死的5只荷瘤兔待肾脏止血后，逐层缝合腹膜、皮下组织及皮肤. 术后青霉素4×105  U,  im,  3 d，2 wk后处死取左肾. 观察肿瘤生长情况，并同上做HE染色病理检查. ②对照组：5只行假性治疗. 同样方法麻醉后开腹，在直视下将18 G针头置入肿瘤包膜下约0.5 mm深处. 不接钬激光治疗仪，拔除针头待肾脏止血后关腹. 术后青霉素4×105  U,  im,  3 d，2 wk后处死取左肾. 观察肿瘤生长情况，同上测量并计算肿瘤体积并做HE染色病理检查.

　　1.2.3HE染色、电子计算机图像分析系统分析将HE染色的切片在光学显微镜下观察组织细胞学改变情况，显微照相系统拍片，病理切片用图像放大装置及CCD相机转换为电信号，采用电子计算机图像分析系统进行热损伤带厚度的测量.

　　1.2.4观察指标①钬激光作用于肾肿瘤的肉眼观察；②钬激光损毁灶的体积及相应钬激光总功率；③组织病改变的观察；④对照组肿瘤体积的测量及病理学改变.

　　统计学处理: 数据以x±s表示，选用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，采用成组t检验及直线回归及相关性分析.

　　2结果

　　2.1动物模型的建立情况有26只种植肿瘤成功，并经病理证实，接种成功率86.7%. 瘤灶中心均位于肾皮质内，除1只有2个瘤灶外，其他均只有1个瘤灶，瘤灶位置不固定，肾上、下极均有瘤灶发现. 瘤灶大小不固定.

　　2.2大体观察在钬激光处理时可见肿瘤结节表面的颜色由灰白色变为白色的凝固斑，中间可见气化的豁口，外围有一圈充血淤血带. 有少量出血、溅血现象，多在1~2 min内自行停止. 无尿瘘发生. 解剖肾脏可见靶区内中央灰白色鱼肉样肿瘤组织变为白色凝固性坏死灶，界限清楚，中间为汽化的缺损区，汽化区外为热损伤带.

　　2.3组织学检查钬激光照射后，光学显微镜下可见浅层为变性坏死带，肿瘤细胞形态消失、核固缩、碎裂、融解，照射范围足够可观察到深层为正常肾组织的充血瘀血带，肾静脉扩张、瘀血，可见较多的炎细胞浸润和小片状出血和血栓形成，肿瘤细胞少见，充血瘀血带与正常组织分界清楚(图1A,B). 部分细胞核完全破裂,仅见胞质内核基质成分. 机图像分析：全部病理切片经电子计算机图像分析显示，毁损灶外周热损伤带宽度均在400～800 μm之间(540±33) μm，照射时间的长短对热损带宽度均无影响. 汽化豁口两侧和底部的热缺损带宽度无差异.

　　图1兔肾VX2肿瘤经钬激光照射后病理表现　略

　　2.4钬激光损毁灶的体积及相应钬激光总功率间的关系随着激光输出功率的增大肿瘤组织损伤灶亦增大. 应用SPSS软件绘制散点图，进行直线相关及回归分析，表明两者之间有良好的相关性（r=0.9521, t=12.06, P=0.000,图2）.

　　图2钬激光总功率与损伤肿瘤组织大小关系散点图　略

　　2.5对照实验实验组及对照组的肿瘤体积分别为(1025.4±156.3), (2645.5±174.2) mm3，两者差异显著(P<0.01). 行病检查见实验组肿瘤组织已被完全破坏，镜下观同上. 对照组病理切片低倍镜下可见肿瘤与肾实质无明显边界的浸润性癌巢，癌细胞排列紧密呈实体巢状，纤维间隔少．新生毛细血管丰富．间质内散在淋巴细胞、浆细胞，并于邻近肾组织中可见散在的小癌巢和血管内瘤栓；高倍镜下见癌细胞染包深，大小和形态不一，胞浆丰富呈淡红染色，未见角化珠；核大而圆，大小、形态不一，异形性明显，核膜清楚，染色.

　　3讨论

　　VX2肿瘤起源于Shope病毒诱导的兔乳头状瘤衍生的鳞癌，是一种可移植的肿瘤细胞株［8］. 其组织类型虽为鳞癌，与临床上最多见的肾癌类型不尽相同，但利用其制成的动物模型仍为目前研究肾肿瘤的最佳途径.  基于肾癌对放射和化学治疗不敏感，目前对肾肿瘤的常规外科治疗为肾切除术. 但在有些情况下，如孤立肾癌、对侧肾功能低下、双肾癌、手术不能耐受者、患者要求保留肾脏等，显然并不适合行肾切除术. 目前针对如上情况一般采用肾部分切除术或是肿瘤剜除术，然而这两种手术均存在手术复杂、难度大、技术要求高、术中出血多、术后并发症多等缺点. 因此探索一种介入或是微创的手术治疗方法，在肾肿瘤的外科治疗中有着相当的意义.
　　
　　钬激光的波长2120 nm，非常接近水的1950 nm吸收峰，其吸收系数为24 cm-1，能很好地被生物组织吸收. 高功率的钬激光被生物组织中的水分吸收后，在其光纤头端产生温度极高(可以使金属熔化)、具有很高压强和冲击力的等离子泡［9］，使组织汽化、切割，而离子泡周围传导的热量可使组织凝固坏死、凝血. 较低功率的钬激光则通过组织直接吸收光能产生热凝固效应. 钬激光的医学应用特点：①由于生物组织的热传导系数小，因此钬激光导致的热凝固损伤的范围是一定的. 穿透深度浅，组织穿透度<0.5 mm，可用于精确的外科切割和止血；② 高能脉冲式. 因为钬激光的这种生物学特性，在临床各科室中已有了相当的应用，而其在肿瘤治疗中的有效性和可行性研究也有一定的报道.
　　
　　我们利用钬激光的这种生物学特性，以制作的兔肾VX2肿瘤动物模型为实验对象，根据实验结果，证实了钬激光在肾肿瘤治疗中的有效性和可行性. 采用照射强度了其对正常兔肾实质的生物学效应剂量，发现随着激光输出功率的增大肿瘤组织损伤灶亦增大. 在对治疗组的全层切片检查中，可见肿瘤原发组织被完全破坏. 在与对照组的比较中可见两者显著不同. 病理切片的电子计算机图像分析显示，在肿瘤组织汽化区外围的热损伤带宽度较固定，均在400～800 μm之间，且汽化豁口四周的热损伤带宽度与豁口底部的热损伤带宽度相比无明显差异，另外，热损伤带之外的正常肾组织切片检查未见明显损伤，表明了钬激光的负损伤小.
　　
　　利用钬激光对肾肿瘤进行治疗具有临床价值. 既可以在影像技术的引导下行穿刺介入治疗，也可以在保肾手术中辅助切割，或者通过腹腔镜进行治疗.

【参考】
  　　［1］ Tooher R，Sutherland P, Costello A，et al. A systematic review of holmium laser prostatectomy for benign prostatic hyperplasia［J］. J Urol, 2004, 17l: 1773-1781.

　　［2］ Monga M, Beeman WW. Advanced intrarenal ureteroscopic procedures［J］. Urol Clin North Am，2004, 3l: 129-135.

　　［3］ Jonler M，Lund L，Bisballe S. Holmium：YAG laser vaporization of recurrent papillary tumours of the bladder under local anaesthesia［J］. BJU Int， 2004, 94(3): 322-325.

　　［4］ Matuoska K，Lida S，Tomyiyasu K，et al. Transurethral endoscopic treatment of upper urinary tract tumors using a holmium：YAG laser［J］. Lasers Surg Med, 2003, 32(5): 336-340.

　　［5］ Buki A，Doczi T, Veto F, et al. Initial clinical experience with a combined pulsed holmium?neodymium-YAG laser in minimally invasive neurosurgery［J］. Minim Invasive Neurosurg, 1999，42(1): 35-40.

　　［6］ 丁新民,保庭毅,马建军,等. 钬激光对兔肾脏实质的生物学效应［J］. 医学工程,2005,13:35-37.

　　［7］ 涂刚, 乔天愚, 何士元,等. 高强度聚焦超声治疗兔肾VX2肿瘤的实验研究［J］. 中华泌尿外科杂志,1999,20(8): 456-458.

　　［8］ 罗沈茹,王迎选,杨立,等. VX2兔肝癌模型的制作及应用［J］. 中华放射肿瘤杂志, 1992, 1: 21.

　　［9］ Cecchetti W，Zattoni F，Nigro F，et al. Plasma bubble formation induced by holmium laser: An in vitro study［J］. Urology, 2004，63：586-590.