转移性骨肿瘤中COX?2, VEGF及微血管密度的关系

【摘要】  目的：探讨转移性骨肿瘤组织中环氧化酶?2蛋白(COX?2)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达及微血管密度值(MVD)三者的相关性，以明确对转移性骨肿瘤实施临床干预的可能性. 方法：采用免疫组化S?P法检测42例转移性骨肿瘤手术标本COX?2, VEGF蛋白及CD34的表达，根据CD34染色结果应用OLYMPUS?VANOX 多功能显微镜，采用DMCⅡ型图像分析系统，测定计数MVD值，并同时取原发性恶性骨肿瘤、良性骨肿瘤标本作为对照，探讨COX?2和VEGF在转移性骨肿瘤的表达情况，以及转移性骨肿瘤组织中MVD值. 结果：COX?2及VEGF在转移性骨肿瘤组的阳性表达率分别为62％和81％，MVD在转移性骨肿瘤组和原发性骨肿瘤组中的阳性表达率均高于良性骨肿瘤组，差异有统计学意义；转移性骨肿瘤组中表达率虽高于原发性骨肿瘤组，但差异没有统计学意义. 提示MVD与骨肿瘤的发生与转移有密切的相关性. 结论：COX?2, VEGF在骨肿瘤转移、过程中可能起重要作用；MVD可作为判断肿瘤恶性程度的客观指标.

【关键词】  环氧化酶?2蛋白

　　0引言

　　恶性骨肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，肿瘤血管为肿瘤快速生长提供充足营养，且新生血管壁薄弱容易被肿瘤细胞侵入［1］，成为肿瘤转移的通道. 环氧化酶?2蛋白（cyclooxyenase?2，COX?2）和血管内皮生长因子（vascular cell growth factor，VEGF）是原发性骨肿瘤组织中最主要的血管生长因子，在其发生和转移过程中占中心地位. 转移性骨肿瘤多为恶性肿瘤经血道转移至骨，有研究显示：尸体活检发现恶性肿瘤发生骨转移高达70％. 本研究旨在探讨转移性骨肿瘤组织中COX?2, VEGF和肿瘤血管生成的关系，以及COX?2, VEGF和微血管密度值（microvessel density，MVD）的内在联系.

　　1对象和方法

　　1.1对象收集兰州大学第一2002?08/2005?12原发灶明确且资料完整的转移性骨肿瘤手术切除标本共42(男29，女13)例，平均年龄60.2(36～82)岁. 并同时取良性骨肿瘤10例、原发性恶性骨肿瘤标本13例作为对照. 所有患者的标本病理诊断均经复检确诊. 即用型COX?2及VEGF鼠抗人mAb, CD34 mAb均购自福建迈新公司. Olympus?VANOX 多功能显微镜及DMCⅡ型图像分析系统和Image?Pro plus v.4.5软件由河南省洛阳正骨医院病理室提供. 其它病理仪器和试剂由甘肃省人民医院病理科提供.

　　1.2方法

　　1.2.1标本制备腊块连续切片，厚4 μm，一个腊块捞片5～6个，分别为HE染色复检、COX?2标记、VEGF标记、CD34标记及阴性对照片或备用. 采用免疫组化SP法检测标本COX?2, VEGF蛋白及CD34的表达. 阴性对照片采用同批PBS为一抗的空白对照片. 切片采用Olympus?VANOX多功能显微镜及DMCⅡ型图像分析系统和Image?Pro plus v.4.5软件进行分析；定性分析COX?2, VEGF, CD34染色程度及阳性细胞百分比，定量分析肿瘤组织CD34标记的微血管密度.

　　1.2.2VEGF阳性结果判定用已知人低分化胃溃疡侵润性腺癌组织VEGF阳性片为阳性对照（福建迈新编号：MAB?0243），阴性对照片采用同批PBS为一抗的空白对照片. 骨肿瘤组织VEGF阳性表达主要在细胞胞质内和细胞膜上，染色由浅黄至棕褐色. 选择高倍镜视野（×400）视野，判定方法Mattern法［2］，按染色深浅分为4级：未见染色为0分（-），染成浅黄即轻度染色为1分（＋），染成棕黄即中度染色为2分（?），染成棕褐色即重度染色为3分（?）；阳性细胞百分比：未见染色为0分（-），染色细胞<25%为1分（＋），染色细胞>25%且<50％为2分（?），染色细胞>50%为3分（?）；两者积分0～2分判定为阴性，>2分为阳性.

　　1.2.3COX?2阳性结果判定用已知人肺腺癌COX?2阳性片为阳性对照（福建迈新编号：RMA?0549）. 骨肿瘤组织COX?2阳性表达主要在细胞胞质靠近细胞核膜的部位，染色由浅黄至棕褐色. 选择高倍镜（×400）视野，判定方法：COX?2免疫组化染色以细胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性染色. 结果评分参照Soslow等方法［3］：用双盲法，结合COX?2阳性细胞百分比及染色强弱两个方面COX?2免疫组化染色评分：a，阳性细胞百分比(0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞占1%~10%；2分，11%~50%；3分，51%~80%；4分，81%~100%). b，阳性细胞染色强度(0，阴性；1分，弱阳性；2分，中度阳性；3分，强阳性). a, b两项乘积即为该例病变的COX?2免疫组化评分， 评分0～2分判定为阴性， >2分为阳性.

　　1.2.4CD34标记的MVD分析采用已知人结肠癌内皮细胞CD34阳性片为阳性对照（福建迈新编号：0034），CD34阳性表达主要在血管内皮细胞. MVD的测定方法：参照Weidner等［4］的方法：CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准；切片在100倍光镜下挑选微血管分布最高密度区域，在200倍光镜下计数5个不重复视野中被CD34染成棕黄色的微血管数，取其平均值作为MVD. 每个与邻近微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管；只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数. 而直径大于8个红细胞的血管，有厚的平滑肌的血管及硬化区的血管不在计数范围内.
　　
　　统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件进行统计学数据分析，按资料类型分别采用χ2检验和方差分析，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2．1镜检原发性骨肿瘤的组织结构多紊乱，与良性骨肿瘤相差较大，血管组织多而密集，排列紊乱，成灶状，甚至满视野均是血管. 转移性恶性骨肿瘤表现尤为突出（图1）.

　　2.2免疫组化COX?2和VEGF免疫组化阳性染色在3组中均呈不均匀表达，不同的切片中表达强度相差较大. 转移性骨肿瘤组和原发性恶性骨肿瘤组中表达均高于良性骨肿瘤组，差异均有统计学意义（P均<0.05）；COX?2在转移性骨肿瘤组中表达高于原发性恶性骨肿瘤组，差异有统计学意义（P<0.05）. CD34染色表达的MVD在转移性骨肿瘤组中和原发性骨肿瘤组中表达均高于良性骨肿瘤组（P均<0.05）；转移性骨肿瘤组中表达高于原发性恶性骨肿瘤组，但差异没有统计学意义（P>0.05）. 在良性骨肿瘤组织组、原发性恶性骨肿瘤组和转移性骨肿瘤组组织中，COX?2的阳性表达率分别为：10％（1/10），54％（7/13）和62％（26/42）；VEGF的阳性表达率分别为：20％（2/10）, 85%(11/13)和81％（34/42）；MVD值分别为（7.77±1.38）个/200倍视野，(20.52±6.74) 个/200倍视野和(25.19±7.26) 个/200倍视野.

　　3讨论

　　转移性骨肿瘤的发生是由肿瘤血管介导的过程. 无血管的肿瘤组织靠周围组织液的渗透只能维持直径约2 mm以下的瘤块生长，实体肿瘤生长直径>2 mm时即可诱发微血管增殖，肿瘤细胞增殖迅速，瘤体增大，并开始具有潜在的转移倾向. 肿瘤血管比正常组织丰富，且是幼稚的血管，其内皮是不完全的，比正常血管的通透性大，十分有利于肿瘤细胞的侵入. 因此肿瘤血管在肿瘤的生长、转移过程中起关键性作用. 这一结果使得越来越多的学者把目光转向研究肿瘤血管的发生过程. 干预肿瘤血管生成是目前肿瘤研究的热点之一，目前恩度已在率先研制成功并即将上市应用于临床.A: 原发性恶性骨肿瘤标本CD34染色  SP ×100； B: 转移性骨肿瘤标本COX?2染色 SP ×400； C:  转移性骨肿瘤标本VEGF染色  SP ×400； D: 转移性骨肿瘤标本 CD34 染色  SP ×200.

　　图1原发性恶性骨肿瘤和转移性骨肿瘤标本CD34, COX?2和VEGF染色　略

　　COX?2是前列腺素合成过程中重要的限速酶，催化花生四烯酸转变为前列腺素；后者通过特异性的受体和过氧化酶体增值物激活受体γ途径，活化巨嗜细胞上调VEGF的产生［5］. COX?2可抑制多种肿瘤细胞凋亡，抑制免疫应答，逃避免疫监视，促进肿瘤血管生成及转移复发，其表达与肺、结肠、前列腺、乳腺及骨肉瘤等肿瘤的浸润、转移和预后有关［6］. VEGF作用于内皮细胞表面的受体，促进血管的生成. VEGF在胚胎发育过程中高水平表达，在正常生理状态下当血管生成管壁时，呈低水平表达. COX?2可能通过诱导VEGF表达而促进肿瘤的新生血管生成，从而促进瘤体的生长. 有研究发现COX?2可使鼠产生VEGF的能力下降94％，选择性COX?2抑制剂可使野生型纤维母细胞产生VEGF的能力减少92％［7］，由此可认为COX?2可能通过影响VEGF的合成从而调节血管生成. 体外实验和流行病学研究已经证实COX?2抑制剂具有较强的抗肿瘤作用，其作用机制可能存在COX?2依赖和COX?2非依赖两种途径. COX?2抑制剂尚可增加传统化疗药物如紫杉菇，5氟尿嘧啶的疗效［8-9］，预示着选择性COX?2抑制剂在肿瘤方面具有良好前景.
　　
　　VEGF被认为是最主要的血管生成因子，其高表达水平是多种肿瘤转移和预后的独立指标. 我们的结果表明COX?2和VEGF在原发性骨肿瘤中表达高于良性骨肿瘤，提示COX?2和VEGF在恶性骨肿瘤发生、过程中可能起重要作用. COX?2和VEGF在转移性骨肿瘤中表达强于原发性骨肿瘤，可见COX?2和VEGF可能参与介导骨肿瘤的转移发生过程. 推测应用COX?2, VEGF抑制剂可应用于防治转移性骨肿瘤的发生和发展.
　　
　　MVD是研究肿瘤血管生成的一个常用指标，与肿瘤的转移复发和预后有关. 本研究显示，MVD在转移性骨肿瘤组和原发性骨肿瘤组中表达均高于良性骨肿瘤组，差异有统计学意义；转移性骨肿瘤组中表达虽高于原发性骨肿瘤组，但差异没有统计学意义. 提示MVD与骨肿瘤的发生与转移有密切的相关性. 推测骨肿瘤增生越活跃，其MVD越高；微血管数目越多，越易生长和转移. 因此，MVD有可能作为预测骨肿瘤转移复发和预后的一项指标.

【】
  　　［1］ Dvorak HF, Nagy JA, Dvorak JT, et al. Identification and characterization of the blood vessels of solid tumors that are leaky to circulating macromolecules［J］. Am J Pathol, 1988, 133(1): 95-109.

　　［2］ Mattern J, Koomagi R, Volm M. Associalion of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel densilv and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma［J］. Br J Cancer, 1996, 73(7):931-934.

　　［3］ Soslow RA, Dannenberg AJ, Rush D, et al. COX?2 is expressd in human pulmonary, colonic, and mammary tumors［J］. Cancer, 2000, 89(12): 2637-2645.

　　［4］ Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma［J］. J Natl Cancer Inst,1992, 84(24):1875-1887.

　　［5］ 步星耀，章翔，易声愚. 角质瘤VEGF基因表达与血管生成和脑水肿的关系［J］. 中华神经外科杂志, 2002, 19:19.

　　［6］ Costa C, Soares R, Reis?Filho JS, et al. Cyclooxygenase 2 expression is associated with angiogenesis and lymph node metastasis in human breast cancer［J］. J Clin Pathol, 2002, 55(6):429-434.

　　［7］ Williams CS, Tsujii M, Reese J, et al. Host cyclooxygenase?2 modulates carcinoma growth［J］. J Clin Invest, 2000, 105(11): 1589-1594.

　　［8］ Hida T, Kozaki K, Ito H，et al. Significant growth inhibition of human lung cancer cells both in vitro and in vivo by the combined use of a selective cyclooxygenase 2 inhibitor, JTE?522，and conventional anticancer agents ［J］. Clin Cancer Res，2002,8(7):2443-2447.

　　［9］ 张有成，王杉，张辉，等. 选择性环氧化酶?2抑制剂NS?398抗结肠癌机制及对5?氟尿嘧啶化疗的辅助作用［J］. 中华医学杂志，2004, 84(7):583-586.