人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用
【关键词】 凋亡诱导因子；,HeLa细胞；,细胞凋亡
Proapoptotic activity of truncated human apoptosisinducing factor on HeLa cells
【Abstract】 AIM: To observe the expression of truncated human apoptosisinducing factor (AIF) gene and its effect on HeLa cells. METHODS: After AIF△1-120 gene was successfully cloned, the shorter truncated human AIF gene (AIF△1-400) was constructed by deleting the Nterminal mitochondrial localization sequence(MLS), the coding sequence of flavine adenine dinucleotide (FAD) binding domain and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) binding domain of AIF protein．The truncated human AIF gene (AIF△1-400) was inserted into the pIRES2EGFP and pcDNA3 eukaryotic expression vectors, and the coexpression vectors were then transfected into HeLa cells with LipofectAMINE． The expression of the truncated AIF gene and its effect on HeLa cells were detected by fluorescence microscope analysis and MTT test． RESULTS: The eukaryotic expression vector containing the truncated human AIF (AIF△1-400) gene was successfully constructed． The AIF protein could be detected in the transfected HeLa cells. After transfection, typical cell apoptotic changes were observed under an electron microscope． MTT test showed that the proliferation of HeLa cells was significantly inhibited． CONCLUSION: The expression of the truncated human AIF(AIF△1-400)gene can induce the apoptosis of the transfected human HeLa cells.
【Keywords】 apoptosisinducing factor; HeLa cells; apoptosis
【摘要】 目的：观察人截短型凋亡诱导因子(AIF△1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法：在AIF△1-120基因克隆成功的基础上进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号,FAD结合结构域和NADH结合结构域（1-400位氨基酸）编码序列的AIF△1-400基因，将其克隆入pcDNA3和pIRES2EGFP真核表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察,MTT检测等方法检测该基因在转染细胞中的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性. 结果：经酶切鉴定与测序证实，带有AIF△1-400的真核表达载体构建成功．瞬时转染后出现细胞形态变化，随转染时间的延长转染细胞数减少，荧光变弱． 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已位于细胞核内． MTT法检测发现AIF△1-400转染后对细胞生长有明显的抑制作用. 结论：AIF△1-400仍然具有诱导HeLa细胞凋亡的作用.
【关键词】 凋亡诱导因子；HeLa细胞；细胞凋亡
0 引言
凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor ，AIF）是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白，全长为613个氨基酸（aa），成熟的AIF分子为559个aa，由3部分构成：1个FAD结合结构域（122～262 aa和400～477 aa）,1个NADH结合结构域（263～399 aa）和1个C末端结构域（478～610 aa）. 在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中［1］. 当凋亡信号刺激时可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接介导细胞核发生凋亡［2-4］. 研究表明AIF介导的细胞凋亡在胚胎形成时期起重要作用［5］. 体外实验证明，显微注射AIF分子能引起分离的细胞核中部分DNA丢失，染色体周边凝集和DNA呈大片段断裂（～50 kb）. 这些作用不受广谱caspases抑制剂zVAD. fmk的抑制，也不受Bcl2过量表达的影响［1］，代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径［5］. 在成功构建AIF△1-120基因的基础上［6］，我们对AIF基因的结构［7］进行了进一步截短并构建AIF△1-400基因，旨在研究其对HeLa细胞的促凋亡活性.
1 材料和方法
1.1材料
pcDNA3AIF△1-120质粒为第四军医大学免疫学教研室构建， E.coli DH5α菌种、 人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养；载体pcDNA3由第四军医大学免疫学教研室保存；载体pIRES2EGFP（ Clontech公司）；Taq DNA聚合酶，DNA限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；新生牛血清（杭州四季青生物公司）；RPMI 1640及脂质体LipofectAMINETM2000（ Invitrogen公司）；山羊抗人AIF多克隆抗体（Santa Cruz公司）；FITC标记兔抗山羊二抗（中杉公司）.
1.2方法
1.2.1引物设计
根据AIF的基因序列设计引物为zy1（5′TTT GGT ACC GAA TTC CACC ATG GAG CCC AAT GTT GAG TTG GCC3′）和zy2（5′TTT TCT AGA GTC GAC TCA GTC TTC ATG AAT GTT GAA TAG3′）.
1.2.2AIF△1-400真核表达载体的构建
以质粒pcDNA3AIF△1-120为模板，用zy1和zy2进行PCR,扩增出AIF基因 400位氨基酸密码子以后的片段. 将该基因片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后克隆入pcDNA3载体的相应位点， 并转化E.coli DH5α菌株， 挑克隆，提取质粒，酶切鉴定，鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序，将测序正确的质粒命名为pcDNA3AIF△1-400. 同时构建绿色荧光蛋白共表达载体pIRES2EGFPAIF△1-400.
1.2.3细胞转染于细胞
转染前24 h，用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞，于放置玻片的24孔板中培养，待细胞达80%汇合率时进行转染. 细胞爬片先用无血清RPMI 1640洗2次，加0.5 mL无血清RPMI 1640. 将1 μg pIRES2EGFPAIF△1-400质粒DNA和2 μL LipofectAMINETM2000分别加于50 μL无血清RPMI 1640中，轻轻振摇5 min，混匀，制成转染液，室温静置20 min后，将转染液逐滴加入爬片细胞中，轻轻混合，置37℃孵育6 h，弃去转染液，加含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640. 分别于转染后24，48和72 h取出玻片，用40 g/L多聚甲醛固定5～10 min后，于荧光显微镜下观察细胞形态. 对照组细胞转染pIRES2EGFP空载体，处理方法与实验组相同.
1.2.4间接免疫荧光检测
将HeLa细胞加至24孔板的玻片上，用脂质体法转染pcDNA3AIF△1-400，同时转染pcDNA3AIF△1-120作为阳性对照，pcDNA3作为阴性对照，于转染后48 h取出爬片，用PBS(pH7. 4)洗3次，40 g/L多聚甲醛固定5～10 min，再经3 mL/L TritonX100穿膜处理后，依次加入1∶100的山羊抗人AIF蛋白的多克隆抗体和1∶100的FITC标记的兔抗山羊二抗. 以PBS洗后，将细胞爬片倒置于载玻片上于荧光显微镜下观察.
1.2.5MTT法测定细胞存活率
将HeLa细胞接种于96孔板中，脂质体法分别转染pcDNA3，pcDNA3AIF△1-400. 每孔转染0.2 μg质粒DNA，于37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养，分别于转染后24，48，72和96 h进行MTT检测. 检测时每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 37℃孵育4 h后吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解结晶，各组均设4个复孔，检测样品的光吸收值，平均值，绘制生长曲线.
2 结果
2.1AIF△1-400的克隆及鉴定
以pcDNA3AIF△1-120质粒为模板，用引物zy1和zy2进行PCR，扩增出约为650 bp的片段（图1）,与预期大小一致，将该片段克隆入pcDNA3的相应位点，经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，测序证实我们所获得的序列完全正确，命名为pcDNA3AIF△1-400. 将测序正确的AIF△1-400用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后克隆入pIRES2EGFP相应位点，命名为pIRES2EGFPAIF△1-400(图2).
2.2AIF△1-400基因在HeLa细胞中的表达分别取
pIRES2EGFPAIF△1-400及pIRES2EGFP转染24，48和72 h后的细胞爬片荧光显微镜观察，瞬转后试验组与对照组相比，对照组生长状态良好，实验组细胞出现细胞形态变化，随转染时间延长，转染细胞数减少，荧光变弱（图3）.
图3AIF△1-400在HeLa细胞中的表达及转染后的HeLa细胞形态变化×200
2.3间接免疫荧光检测转染pcDNA3组的细胞中，AIF呈点状分布，而转染
pcDNA3AIF△1-120及pcDNA3AIF△1-400组的细胞中截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已经位于细胞核内（图4）.
A: 1~3: pcDNA3组; B: 1~3: pcDNA3AIF△1-120组; C: 1~3: pcDNA3AIF△1-400组.
2.4AIF△1-400基因对HeLa细胞增殖的影响
pcDNA3AIF△1-400转染后其基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用（图５）.
3 讨论
细胞凋亡是所有多细胞生物所具有的一种基本特征，有重要的生理意义. 目前普遍认为，caspases是介导细胞凋亡的主要分子，但是在大部分应激诱导的哺乳动物凋亡模型中，caspases的抑制剂并不能完全阻止细胞凋亡的发生［8-10］. 近年来发现，有独立于caspases信号通路之外的另一条凋亡途径存在，即存在由AIF直接介导的细胞凋亡途径［4-5，11-12］. AIF在多种组织中广泛分布，基因定位于X染色体上. AIF前体蛋白在细胞内合成后，通过其N末端的线粒体定位信号可有效地穿入线粒体膜间隙，然后在102位甘氨酸处水解掉MLS，其余部分再与黄素腺嘌呤二核苷酸结合，并重新折叠为具有促凋亡潜能的成熟AIF分子. 当凋亡信号刺激时，可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接导致核的早期凋亡形态变化，包括大片段DNA断裂的产生和初期的外周染色体的凝集［1,13］. 基因敲除实验发现，AIF／γ小鼠胚胎期可致死. 在进一步体外模拟哺乳动物早期胚胎发生过程中发现，AIF的促凋亡活性是小鼠形态发生过程中胚体腔形成所必需的［5］, 而且该过程是AIF独立作用的结果.
以往的研究证实AIF△1-120［6］及 AIF△1-352［13］等截短分子均具有促凋亡活性. 我们的研究用PCR的方法扩增出了去除AIF基因线粒体定位信号FAD和NADH结合结构域（1～400 aa）编码序列的AIF△1-400基因，克隆入pcDNA3及pIRES2EGF的真核表达载体后，转染HeLa细胞.
将pIRES2EGFPAIF△1-400基因瞬转HeLa细胞后，出现细胞形态变化，随转染时间延长，转染细胞数减少，荧光变弱. 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已经位于细胞核内. 用MTT法检测发现AIF△1-400转染后基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用.
AIF的致凋亡作用不受caspases的抑制剂(如zVAD. fmk，IAP等)的抑制，也不受上游凋亡信号的控制，具有作为肿瘤杀伤分子特殊的优越性. 我们对AIF基因进行了改造，构建了AIF△1-400基因，并初步证实人AIF基因去除线粒体定位信号，FAD和NADH结合结构域后仍具有促凋亡活性，与AIF基因相比，这种截短型AIF基因由于具有分子质量小的特征，更有利于应用.
【】
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